重癥監護病房醫院感染銅綠假單胞菌耐藥性及脈沖場凝膠電泳分型

龐杏林, 陳守義, 鄧志愛, 張欣強, 李孝權, 胡玉山

銅綠假單胞菌(Pseudomonas areuginosa,Pa)是臨床上最常見的一種引起醫院感染的條件致病菌,由Pa引起的醫院感染發生率＞30%[1]。Pa對多種抗生素往往存在天然耐藥性,由該菌引起的醫院感染的流行已受到廣泛關注。近年來隨著細菌分子分型方法的發展,監測和控制醫院感染的水平有了很大的提高,脈沖場凝膠電泳(PFGE)就是其中的一種細菌分子分型技術,PFGE被認為是目前細菌分子流行病學研究“金標準”,是公認的醫院感染調查最好的分型方法[2]。本研究對ICU中分離的14株Pa菌株進行PFGE分型及耐藥性分析,以確定Pa菌株的克隆構成,了解ICU中Pa感染的分子流行病學特征。

材料與方法

一 、材料

(一)實驗菌株 14株Pa分離自 2008年5—6月廣州市某三級甲等醫院ICU,臨床診斷為醫院獲得性肺炎患者的下呼吸道標本[3]。標準菌株為Pa ATCC27853。

(二)主要試劑與儀器 培養基為廣州迪景公司商品,采用法國生物梅里埃公司VITEK-2全自動微生物鑒定儀、VIT EK GNI細菌鑒定卡和英國OXOID公司10種藥敏紙片。SPeI酶為TaKaRa公司產品,蛋白酶K為Merck公司產品,脈沖場電泳儀及Gel Dos XR成像系統均為美國Bio-Rad公司產品。

二 、方法

(一)細菌鑒定與藥敏試驗 細菌分離、培養、鑒定和藥敏試驗均嚴格按照《全國臨床檢驗操作規程》(第3版)進行。采用VITEK-2全自動微生物鑒定儀作細菌鑒定,10種抗菌藥物藥敏試驗采用紙片擴散法(K-B法),以Pa ATCC27853作質控株。以CLSI M100-S17版的標準判讀藥敏結果[4]。

(二)PFGE 將Pa菌株均勻洗脫于 200 μ L細胞懸浮液中,菌液濃度調為1.0麥氏單位,用蛋白酶K進行消化,低熔點瓊脂糖凝膠包埋消化過的Pa,倒入模具制成膠塊,切取4 mm×4 mm大小的膠塊加入限制性內切酶SPe I 30 u,在37℃水浴中酶切過夜。酶切膠塊進行1%低熔點瓊脂糖凝膠電泳,電泳參數為電壓6 V/cm,夾角120°,溫度14 ℃,第1階段脈沖時間5～15 s,電泳時間9 h,第2階段脈沖時間15～50 s,電泳時間9 h。用沙門菌H9812作為分子量對照。電泳完畢后膠塊用1 mg/L的EB染液染色30 min,超純水漂洗2次,每次 20 min。膠塊置成像儀閱讀結果,使用BioNumerics version 4.0軟件,選擇Dice相關系數和UPGMA方法進行PFGE結果處理和聚類分析。

結 果

一、PFGE分型結果

14株Pa菌株PFGE指紋圖見圖1,Pa菌株的全基因組DNA經過SPe I酶切后,通過PFGE分析產生18～27個條帶,條帶分子量大小范圍20～1 200 kb。14株Pa菌株PFGE電泳聚類分析結果見圖2,PFGE電泳條帶相似度在76%～100%,根據相似度100%者視為同型株,可將14株Pa分6個型別,命名為A 、B、C、D 、E 和F型 。其中 A 型為優勢菌株共8株(57.1%),B型2株(14.3%),其余型別各有1株(分別占7.1%)。

二、藥敏試驗結果

14株Pa藥敏試驗結果見表1。Pa對10種抗菌藥物產生不同程度的耐藥性。根據藥敏試驗結果分析發現分子A型Pa可產生2種耐藥表型,有5株A型Pa產生相同的耐藥表型,對10種抗菌藥物100%耐藥,其余3株A型Pa對頭孢他啶、阿米卡星和氨曲南3種抗生素敏感,對其他7種抗菌藥物耐藥。2株B型Pa中除了1株對環丙沙星產生耐藥外,其余均為敏感。C型Pa對環丙沙星耐藥,D型和E型Pa對妥布霉素耐藥,F型Pa對10種抗菌藥物均敏感?；颊咂骄≡簳r間為67 d,平均年齡74歲,基礎疾病為慢性阻塞性肺疾病(COPD),治療期間接受過氣管插管或呼吸機人工通氣及電動吸痰等有創性治療措施,有激素治療史,而且均有第三代或第四代頭孢菌素及亞胺培南等抗生素用藥史。Pa耐藥表型與臨床資料見表2。

表1 14株Pa的藥敏結果Table 1.Susceptibility of 14 Pseudomonas aeruginosa strains to antimicrobial agents

表2 14株銅綠假單胞菌耐藥表型與臨床資料Table2.Baseline clinical data and susceptibility of 14 Pseudomonasaeruginosa strains to antimicrobial agents

討 論

Pa廣泛存在于自然界,可定植于人體的皮膚、呼吸道、腸道和尿道,是一種重要的條件致病菌,對多種抗生素天然耐藥。隨著抗生素廣泛使用,Pa已成為醫院獲得性肺炎最常見的病原菌。來自國內外的研究均顯示：Pa是醫院獲得性感染的最主要的病原菌之一[5-6]。在ICU中Pa的感染容易以暴發形式發生,暴發流行往往是由同一克隆株,通過某種傳播途徑,在同一病區內引起不同患者的交叉感染。本次研究在ICU臨床分離的14株Pa菌株中有8株同為PFGE分型A型菌株,具同源性,應視為暴發流行株。分析結果表明在相近的時間段內,曾經存在著某種途徑引起該菌株在ICU患者之間的克隆傳播。追溯病史可以發現患者平均住院時間為67 d,平均年齡74歲,均存在較嚴重的基礎疾病以及各種合并癥,治療期間都接受過氣管插管、呼吸機人工通氣及電動吸痰等有創傷性治療措施,有激素治療史,而且均有第三代或第四代頭孢菌素及亞胺培南等抗生素用藥史。說明ICU中容易發生Pa引起的醫院感染是與老齡患者、住院周期長、免疫功能低下、大量抗生素使用和激素治療、使用各種侵襲性操作等因素相關。宿主防御能力受損的重癥患者罹患Pa感染的危險較大。

本研究資料顯示,Pa對常用于治療產ESBLs菌感染的亞胺培南 35.7%耐藥,與文獻報道相符[7]。亞胺培南屬于碳青霉烯類抗生素,由于該藥抗菌譜廣,對產ESBLs和AmpC的細菌具有良好的抗菌活性,而被認為是治療多重耐藥細菌的理想藥物。但是,近年來亞胺培南在臨床上廣泛應用,其耐藥率也逐年增加,Pa對亞胺培南耐藥性尤為明顯[7]。本研究14株Pa中5株(35.7%)對亞胺培南耐藥。Pa對亞胺培南產生耐藥與產生IMP、VIM、SPM、GIM型金屬β內酰胺酶、GES-2型β內酰胺酶和外膜蛋白oprD2缺失相關[8]。其他機制尚有靶位結構改變、生物膜的形成等[9]。加強對碳青霉烯類抗生素的耐藥性檢測及耐藥機制的研究,指導臨床合理應用該類抗生素,延緩其耐藥性的發展。阿米卡星也是臨床治療Pa使用的一線藥物,但資料顯示Pa對阿米卡星的耐藥率為35.7%,相關文獻報道可高達56%[10]。這也說明,對于產酶和泛耐藥的Pa臨床應該選用何種抗生素予以治療已是一大難題,而抗生素的規范使用是避免細菌產生耐藥性的首要原則。

國內外至今沒有建立標準的Pa菌PFGE實驗程序,本研究擬探索和優化PFGE應用于Pa分型的實驗條件,建立本實驗室的Pa菌PFGE實驗程序。與文獻對比[11-12],發現一些不同之處,如在Pa最佳菌液濃度的調整上,分別用了3種菌液濃度：0.5、1.0和2.0麥氏單位,結果表明1.0麥氏單位的菌液濃度時DNA電泳條帶最佳,由此說明,菌量的過多、過少都會影響電泳條帶的清晰度。限制性內切酶的選用在PFGE中是至關重要的,本研究中分別選用了Xba I和Spe I 2種限制性內切酶進行酶切,Spe I酶切條帶相對較多,酶切效果較理想。電泳時間上比較了16、18和20 h的電泳效果,16 h電泳時間過短,沒有充分分開酶切條帶的電泳距離,可辨性低,而20 h電泳時間過長,小于50 kb的酶切片段電泳于凝膠外,18 h電泳時間既保留了所有DNA酶切片段又可以有效分辨DNA條帶的距離,所以確定18 h為最合適的電泳時間。實驗證明,本研究選擇的PFGE方法和條件是適宜的,具有較好的分型性、分辨力和重復性,是理想的細菌分型方法,能準確地反映病原的流行病學相關性。

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