川芎嗪促進腦缺血耐受形成的作用及機制研究

胡永紅，周愛民，田 野，朱鈺寶

(石家莊市中醫(yī)院河北醫(yī)科大學，河北石家莊 050051)

本實驗觀察川芎嗪干預腦預缺血(CIP)的效果及其促進腦缺血耐受的形成，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

健康昆明小鼠96只，雌雄不拘，體重30g～40g，河北醫(yī)科大學實驗中心提供，在實驗室常規(guī)飼養(yǎng)2d后用于實驗。鹽酸川芎嗪注射液購自石家莊樂仁堂藥店;10%水合氯醛由天津市化學試劑廠生產;多聚甲醛為張家口市化工試劑廠生產;Bax兔多克隆抗體、Bcl-2鼠單克隆抗體、生物素標記二抗由北京中山生物公司生產;NO試劑盒、NOS試劑盒為南京建成生物公司;TGL-16G-A型低溫高速離心機由上海安亭科學儀器廠生產;DK-600A型電熱水浴恒溫箱由上海一恒科技公司生產;光學顯微鏡為重慶光電儀器公司生產;病理圖像采集系統(tǒng)為日本olympus。

1.2 方法

將96只健康昆明小鼠隨機分為假手術組、缺血損傷組、BIT模型組、TMP干預BIT組4組，每組24只。TMP干預組用川芎嗪按40mg/kg/d腹腔注射，連續(xù)3d;假手術組、缺血損傷組腹腔注射等量生理鹽水。第1次腹腔注射30min后所有小鼠經(jīng)10%水合氯醛0.33ml/100g腹腔麻醉，仰臥固定于手術臺上，頸前正中開口，鈍性分離雙側頸總動脈。BIT模型組、TMP干預BIT組用微動脈夾夾閉雙側頸總動脈6 min作為預處理，然后恢復灌流。假手術組、缺血損傷組只暴露雙側頸總動脈6 min，不阻斷血流。最后1次腹腔注射30min后，所有小鼠經(jīng)乙醚吸入麻醉，暴露雙側頸總動脈，缺血損傷組、BIT模型組、TMP干預BIT模型組均阻斷血流40 min，然后恢復灌流;假手術組只暴露頸總動脈40min，不阻斷血流;術中及術后注意保暖，正常飲食。術后24h從各組隨機選取12只小鼠斷頭處死，迅速剝取全腦，左側半球低溫保存，采用生化方法檢測腦組織NOS活性和NO含量;右側半球用4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟切片，采用免疫組化方法檢測海馬組織Bax和bcl-2蛋白表達。其余小鼠于術后7d全部處死，迅速剝取全腦，冠狀切取視交叉后1mm～4mm腦片，多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察海馬CA1區(qū)組織學分級和神經(jīng)元密度(neuronal density，ND)。

1.3 檢測指標

1.3.1 參照 Kitagawa和 Kato[1]分級方法，對海馬CA1區(qū)域組織學改變進行分級(0級:無神經(jīng)元死亡;1級:散在的神經(jīng)元死亡;2級:成片的神經(jīng)元死亡;3級:幾乎全部的神經(jīng)元死亡)。

海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度在高倍鏡下記數(shù)雙側海馬CA1區(qū)每1mm區(qū)段未死亡的錐體細胞數(shù)目，每側記數(shù)3個區(qū)段，取其平均數(shù)為神經(jīng)元密度(neuronal density，ND)。

1.3.2 小鼠腦組織NO和NOS含量測定 用預冷的生理鹽水制備10%腦組織勻漿，3500r/min離心10min，取上清液，采用分光光度法測定組織中NOS活性，按每毫克組織蛋白每分鐘生成1nmol NO為1個酶活力單位。采用硝酸還原酶法檢測組織中NO2－/NO3－含量(μmol/gprot)間接反映 NO 含量。

1.3.3 Bax及bcl-2蛋白表達測定 通過觀察海馬CA1區(qū)bcl-2、Bax陽性細胞數(shù)占片中神經(jīng)元總數(shù)的百分比分級情況來反映bcl-2、Bax蛋白表達情況。bcl-2、Bax陽性細胞是指胞漿及胞膜內側出現(xiàn)棕黃色顆粒的海馬神經(jīng)元?！罏殛栃约毎麛?shù)20%，+為陽性細胞數(shù)20% ～50%，++為陽性細胞數(shù)50%～75%，+++為陽性細胞數(shù)>75%。每只小鼠隨機取1張切片，陽性細胞數(shù)分級越高，反映bcl-2、Bax蛋白表達越強。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結果

2.1 術后7d海馬CA1區(qū)組織病理學改變

圖1顯示，假手術組海馬CA1區(qū)無明顯組織學損傷，錐體細胞排列整齊致密，形態(tài)完整，胞核飽滿，核仁清晰，組織學分級多為0級和1級。圖2顯示，缺血損傷組海馬CA1區(qū)組織學損傷明顯，主要表現(xiàn)為錐體細胞缺失較多，殘留的錐體細胞排列松散不規(guī)則，多數(shù)錐體細胞胞核固縮，組織學分級多為2級和3級，與假手術組相比有顯著性差異(P<0.01)。圖3顯示，BIT模型組海馬CA1區(qū)組織學損傷較亦明顯，組織學分級多為2級和3級，與缺血損傷組相比無差異(P>0.05)。圖4、表1顯示，TMP干預BIT模型組海馬CA1區(qū)組織學損傷較缺血損傷組和BIT模型組明顯減輕，錐體細胞排列較整齊，胞核飽滿，核仁較清晰，有散在的錐體細胞缺失或胞核固縮，組織學分級多為1級和2級(P<0.05)，但仍明顯低于假手術組(P<0.01)。

圖1 假手術組海馬CA1區(qū)組織學表現(xiàn)(HE染色×400)

圖2 缺血損傷組組海馬CA1區(qū)組織學表現(xiàn)(HE染色×400)

圖3 腦預缺血組海馬CA1區(qū)組織學表現(xiàn)(HE染色×400)

圖4 川芎嗪干預組海馬CA1區(qū)組織學表現(xiàn)(HE染色×400)

表1 術后7d海馬CA1區(qū)組織學分級資料

表2 腦缺血術后7d海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度

表2顯示，與假手術組相比，缺血損傷組、BIT模型組、TMP干預BIT模型組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度明顯降低(P<0.01)。缺血損傷組、BIT模型組之間無顯著性差異(P>0.05)，TMP干預BIT組神經(jīng)元密度明顯高于BIT模型組和缺血損傷組(P<0.01)。

2.2 術后24h腦組織NOS活性和NO含量變化

表3顯示，與假手術組相比，缺血損傷組、BIT模型組、TMP干預BIT組小鼠腦組織中NOS活性和NO含量明顯升高(P<0.01)，缺血損傷組、BIT模型組之間無顯著性差異(P>0.05)，TMP干預BIT模型組NOS活性及NO含量較缺血損傷組、BIT模型組明顯降低(P<0.01)。

表3 術后24h腦組織NOS活性和NO含量變化(s)

表3 術后24h腦組織NOS活性和NO含量變化(s)

注:*P<0.01 vs假手術組;△△P<0.01 vs BIT模型組;△P>0.05，☆P<0.01 vs缺血損傷組

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2.3 術后24h海馬CA1區(qū)Bax和bcl-2蛋白表達

表4、5顯示，假手術組Bax可見微弱表達，bcl-2未見明顯表達。與假手術組相比，缺血損傷組、BIT模型組、TMP干預BIT模型組Bax、bcl-2表達明顯增多(P<0.01)，而缺血損傷組、BIT模型組之間無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。TMP干預BIT模型組與缺血損傷組比較，Bax表達明顯減少(P<0.05)，bcl-2表達明顯增多(P<0.01)。與BIT模型組相比，Bax表達明顯減少，bcl-2表達明顯增多(P<0.05)。

表4 術后24h海馬CA1區(qū)bcl-2蛋白表達

表5 術后24h海馬CA1區(qū)Bax蛋白表達

3 討論

預處理現(xiàn)象(ischemic preconditioning，IP)最早是由Murry等于1986年在犬心肌缺血模型中發(fā)現(xiàn)的，繼后大量研究進一步肯定了心肌缺血預處理的保護作用，且已有臨床應用報道。自從1990年腦缺血預處理誘導腦缺血耐受被發(fā)現(xiàn)以來，這種激發(fā)自身機制對嚴重腦缺血產生保護作用的方法受到了人們的廣泛關注[1]。通過對這種自發(fā)性保護機制的深入研究，發(fā)現(xiàn)其中有效的保護效應因子及劑量，最終應用于臨床，將具有極大的應用前景。從某種意義上講，輕微、短時的腦缺血不但對機體無害，反而具有一定的腦保護作用，使神經(jīng)元對抗較重腦缺血的能力得以提高，這引起人們深思。為什么有短暫性腦缺血發(fā)作(transient ischemic attacks TIA)經(jīng)歷的病人，當其發(fā)生腦梗塞時，與無TIA發(fā)作者相比梗塞面積往往較小，病情也往往較輕，預后相對較好。這似乎進一步從臨床角度部分驗證了CIP的腦保護作用，然而仍然有相當一部分TIA病人會最終甚至很快發(fā)生腦缺血性卒中。這說明CIP的腦保護作用是有限的，僅靠臨床病人被動TIA發(fā)作來增強腦組織抗缺血缺氧能力是很不充分的，況且TIA本身就預示著較嚴重腦缺血發(fā)生的可能性大大增加。因此，采用有效手段來干預CIP，進一步加強其神經(jīng)保護作用，這對于作為缺血性腦卒中高危人群的TIA患者來講，可能是更為積極、有效的預防和治療措施。

川芎(ligustrazine)是臨床上常用的1味活血化瘀藥，為傘行科藁木屬植物的根莖，枯草桿菌的代謝產物，性辛溫，歸肝膽心包經(jīng)，具有活血行氣、祛風止痛功能，為血中氣藥?，F(xiàn)代藥理學研究表明，川芎的主要成分含有生物堿、阿魏酸等酚性物質，又含有揮發(fā)油內酯類以及維生素A、甾醇、葉酸等。大量臨床觀察證明[2～5]，川芎具有清除自由基、抗脂質氧化作用、抑制缺血組織細胞凋亡、抑制鈣超載等作用，在治療缺血性腦血管病及其后遺癥上均有較好療效，而且無明顯毒副作用。而氧化應激和細胞凋亡是腦缺血后神經(jīng)元損傷的重要機制，Bax和bcl-2是細胞凋亡的重要調節(jié)基因，NO及NOS也在其中起著重要作用。

bcl-2是一種抗凋亡基因，其廣泛存在于上皮細胞、造血細胞、淋巴細胞、神經(jīng)細胞及多種瘤細胞中。實驗表明，缺血預處理后，側腦室持續(xù)輸注 bcl-2反義寡聚脫氧核苷酸72h后再次給予60min的缺血，bcl-2的表達減少并阻斷缺血預處理后腦缺血耐受的形成，說明bcl-2在腦缺血耐受的形成中起著重要作用[6]。大量動物實驗證明，bcl-2表達上調是預缺血處理產生腦保護作用的機制之一。Bax是一種促凋亡基因，Bax缺乏鼠腦缺血缺氧后海馬區(qū)受損的細胞明顯減少。細胞受刺激后是否存活取決于bcl-2/Bax表達比率，比值越高，細胞存活率越高;比值越低，細胞凋亡率越高。Brambrink等給大鼠腹腔注射3-NPA(一種線粒體毒素)預處理后，使用實時反轉錄聚合酶鏈反應技術定量分析結合免疫組織化學分析，轉錄水平和翻譯水平的 bcl-2/Bax比率均升高。由此可見，Bax基因家族可通過其成員間的相互作用對細胞的存活和凋亡進行調節(jié)，并參與腦缺血耐受的形成。

近些年來，對NO及NOS在腦預缺血中的作用越來越受到人們的重視。如觀察缺氧預處理的離體大鼠海馬腦片的電活動，發(fā)現(xiàn)第2次缺氧復氧后誘發(fā)電位波幅得到明顯恢復，NOS阻斷劑7NI抑制腦片神經(jīng)細胞電活動的恢復，提示cNOS產生的NO參與了缺氧預處理對神經(jīng)元的保護作用。關于整體下NO是否參與BIT的誘導，導師周愛民的實驗證明，整體水平下NO參與大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞BIT的誘導過程，并發(fā)現(xiàn)CIP誘導BIT時，可使海馬CA1區(qū)NOS表達增加，因此提出適量的NO增加，可能是CIP保護作用的機制之一。

本實驗觀察到，BIT模型組與缺血損傷組相比，bcl-2蛋白、Bax蛋白表達無明顯變化，小鼠腦組織NO含量及NOS活性無顯著變化，進一步證明了6min的預缺血處理的保護作用是有限的，它保護不了后續(xù)40min的嚴重缺血損傷。川芎嗪干預BIT模型組Bax蛋白表達明顯低于BIT模型組，bcl-2蛋白表達明顯高于BIT模型組，NO含量明顯減低，NOS活性減弱。由此推測，川芎嗪可能與CIP有協(xié)同作用，進一步提高bcl-2/Bax比例，增強抗凋亡效應，減少自由基損傷，促進腦缺血耐受的形成。這可能是川芎嗪增強CIP腦保護作用的重要機制。

然而，CIP腦保護作用及其機制的研究剛剛起步，采用中醫(yī)藥手段干預CIP促進腦缺血耐受形成的報道更少，因此可供借鑒的經(jīng)驗極其有限。川芎嗪增強CIP腦保護作用的價值到底有多大?川芎嗪干預CIP增強腦缺血耐受是兩者作用的簡單相加，還是兩者確實有協(xié)同效果，抑或是兩者之間根本就不存在相互作用等諸多疑問，均有待進一步深入探討。

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