補陽還五湯家兔含藥血清對家兔血小板PAF受體活性的影響

張繼平，宮 麗，李齊歡，姚 暉，文鳳妮，李蜀光，林愛華，王志彬

(佛山市第二人民醫院，廣東佛山 528000)

補陽還五湯出自清代名醫王清任的《醫林改錯》，由生黃芪 120g，歸尾 6g，赤芍 4.5g，川芎、桃仁、紅花、地龍各3g組成，該方以其補氣、活血、通絡之功一直用于臨床，療效顯著，是目前治療中風等血栓性疾病的經典名方。我們前期研究發現，補陽還五湯多次體內給藥有提高家兔血小板活化因子(Platelet-activating Factor，PAF)受體與［3H］-PAF 放射配基特異結合量和特異結合率的趨勢，其作用與PAF特異性受體阻滯劑銀杏葉提取物無顯著差異;補陽還五湯注射液體外給藥有抑制家兔洗滌血小板PAF受體與放射配基的特異結合的作用。1988年日本學者田代真一正式提出“中藥血清藥理學”概念，中藥血清藥理學方法可在某種程度上克服中藥本身的理化因素對實驗結果的干擾，在中藥復方的藥理研究中具有極強的針對性。目前，已見神經細胞或內皮細胞保護方面的補陽還五湯血清藥理學研究報道，但該方在抑制血栓的作用機理方面的血清藥理學研究尚未見報道。本文在前期研究的基礎上，結合血清藥理學和放射配基受體結合法，研究補陽還五湯家兔含藥血清對家兔血小板PAF受體活性的影響，以進一步闡明該方防治血栓性疾病的藥理作用機制。

1 材料

1.1 動物

新西蘭白色家兔，體重2.0kg～3.0kg，實驗動物和動物實驗設施由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供［動物合格證號粵監證字2006A006 SYXK(粵)2003-0001，動物環境設施合格證號SYXK(粵)2003-0001］。

1.2 藥物

飲片于佛山市康普醫藥公司和健民醫藥公司購得，按文獻方法制備補陽還五湯水煎液(含生藥量分別為1.16g生藥/ml、2.9g生藥/ml)和不含黃芪的補陽還五湯水煎液(組方為赤芍4.5g，歸尾6g，川芎、桃仁、紅花和地龍均為3g，含生藥量為2.9g生藥/ml)。將金納多片(批號8281005)研成細末，用蒸餾水配制成4.84mg/ml(按照家兔體表面積換算的臨床等效劑量的5倍)水溶液。

1.3 試劑

放射性同位素:［3H］-PAF(Amersham 公司，包裝量 250Ci，比活值 175Ci/mmol，批號 200402)，PAF標準品 5mg(L-105，PAF-18，Biomol公司，批號P1318V)，小牛血清白蛋白(BSA，MBChem分裝，批號20041108)，三羥甲基甲烷(Tris，進口分裝，批號20030518)，2.5-苯基惡唑(PPO)及二甲基-POPO(Fluka Chemie瑞士，批號290981889)，其他試劑均為國產分析純。

1.4 儀器

LS-5810 型液閃儀(Beckman，美國)，ZT-Ⅱ型多頭細胞分離器(浙江紹興衛星機械公司)，KDC-2046低速冷凍離心機(安徽科大創新股份公司中佳分公司)，WMZK-08型電熱恒溫干燥箱(廣州東方紅醫療器械廠)，YKH-Ⅱ型液體快速振蕩器(廣東汕頭廣播儀器廠)，微量加樣器、超低溫生物冰箱(日本SANYO公司)，其他冰箱(國產)、水浴箱、一次性注射器、試管等。

2 方法

2.1 含藥血清的制備

2.1.1 動物分組 新西蘭家兔30只，雌雄各半，根據體重用隨機數字表法隨機分為補陽還五湯水煎液低劑量組(A組)、補陽還五湯水煎液高劑量組(B組)、不含黃芪的補陽還五湯水煎液組(C組)、金納多組(D組)、蒸餾水組(E組)5組。

2.1.2 含藥血清的制備 A組:用1.16g生藥/ml補陽還五湯水煎液10ml/kg灌胃;B組:用2.90g生藥/ml補陽還五湯水煎液10ml/kg灌胃;C組:用2.90g生藥/ml不含黃芪的補陽還五湯水煎液10ml/kg灌胃;D組:用4.84mg/ml金納多水溶液10ml/kg灌胃;E組:用等體積蒸餾水10ml/kg灌胃。每天1次，連續灌服5d，每組灌胃的藥物體積相同。有文獻報道，在96個藥物口服后達峰時間中，藥物口服給藥后1h～2h內達峰的占藥物總數的91.66%，故在末次給藥前禁食12h，給藥結束2h后家兔清醒狀態下取耳中央動脈血10ml，室溫靜置2h后離心(4℃ 2500r/min 10min)分離后的家兔血清于56℃水浴中30min滅活，分裝，－40℃冰箱凍存備用。

2.2 ［3H］-PAF與洗滌血小板PAF受體結合測定

2.2.1 家兔洗滌血小板懸液的制備 正常家兔清醒狀態下頸總動脈插管取血40ml，用3.8%枸櫞酸三鈉抗凝(血:抗凝劑，9∶1)混勻后塑料試管分裝，在4℃ 1000r/min(離心力200×g)離心10min，取上層富含血小板血漿加等體積的磷酸緩沖液(KH2PO40.22g，Na2HPO40.86g，檸檬酸 0.86g，葡萄糖0.44g，溶于500ml蒸餾水中，pH 6.5)混勻，在4℃ 2900r/min(離心力1682g)離心10min，取沉淀用等體積的磷酸緩沖液混勻，4℃ 3000r/min(離心力1800g)離心5min后棄上清，取血小板沉淀，重復洗滌1次;取沉淀的血小板加入含有0.1%BSA和1mmol/L的MgCl2磷酸緩沖液中，稀釋成(2.5～6)×107/ml的血小板懸浮液(PRP)備用。

2.2.2 放射配基受體結合實驗 總結合管(T):取 PRP 380μl+［3H］-PAF 10μl(0.35nmol/L，濃度為終濃度，下同)+蒸餾水5μl;非特異結合管(P):取 PRP 380μl+［3H］-PAF 10μl(0.35nmol/L)+冷PAF 5μl(1μmol/L);樣品管(Y):取PRP 380μl+［3H］-PAF 10μl(0.35nmol/L)+含藥血清 5μl;以上每管平行作三管，取均值計算之。加樣完畢后，在振蕩器上混合振搖30s，然后在25℃溫浴40min，用含有0.1%BSA的冰冷Tris緩沖液終止反應，用多頭細胞分離器真空抽濾，過濾分離游離與結合的［3H］-PAF，濾紙用冰冷的Tris緩沖液洗4次，濾紙片放入紅外線烘箱內(80℃，1h)烘干，置2ml已測本底的二甲苯閃爍液中，在液閃儀中測定放射性。計算特異結合率=［(T－P)/T］×100%和特異結合抑制率=［(T－Y)/(T－P)］×100%。

2.3 統計學方法

3 結果

3.1 補陽還五湯家兔含藥血清對［3H］-PAF與家兔血小板PAF受體結合的影響

表1顯示，補陽還五湯含藥血清能明顯抑制［3H］-PAF與家兔洗滌血小板PAF受體的特異結合，其抑制作用明顯強于蒸餾水組(P﹤0.01)，弱于金納多組(P﹤0.01);補陽還五湯高、低劑量組和不含黃芪的補陽還五湯組對［3H］-PAF與家兔洗滌血小板PAF受體特異結合的抑制率作用依次為不含黃芪的補陽還五湯組>補陽還五湯低劑量組>補陽還五湯高劑量組，但統計學比較無顯著性差異(P>0.05)。

表1 補陽還五湯含藥血清對［3H］-PAF與家兔血小板PAF受體結合的影響(±s)

表1 補陽還五湯含藥血清對［3H］-PAF與家兔血小板PAF受體結合的影響(±s)

注:同蒸餾水組比較:**P<0.01;同金納多組比較:△△P<0.01

組別 n 特異結合率(%)特異結合抑制率(%)補 陽 還 五 湯 低 劑 量 組 6 27.70±3.00**△△ 57.5± 6.23**△△補 陽 還 五 湯 高 劑 量 組 6 34.5 ±5.74**△△ 47.5 ±14.06**△△不 含 黃 芪 補 陽 還 五 湯 組 6 23.5 ±6.77**△△ 63.9 ±11.92**△△金 納 多 組 6 13.4±4.94** 84.2±12.33**蒸 餾 水 組 6 40.5±5.94△△ 27.9±10.27△△

4 討論

PAF來源相當廣泛，體內血小板、中性粒細胞、巨噬細胞、血管內皮細胞、神經元、心肌細胞等多種細胞受到刺激后均能產生并釋放PAF。PAF具有廣泛的生物學作用，如強烈激活血小板作用、促進中性粒細胞聚集、增加血管通透性等。PAF的多種生物學效應要通過與其受體的特異性結合來實現。PAF受體是一種G蛋白偶聯受體，用3H-PAF或PAF拮抗劑3H-WEB2086進行配體結合實驗，證明在人和動物許多組織和細胞表面都存在有PAF受體，其中血小板是PAF受體含量最多的組織之一。PAF是迄今發現體內作用最強的血小板聚集劑，其特有的磷脂結構與血小板膜受體結構結合后，通過激活膜磷脂代謝及激發鈣離子進入血小板使血小板聚集。PAF誘導的血小板聚集過程，不依賴于二磷酸腺苷(ADP)或花生四烯酸(AA)的代謝產物血栓素A2(TXA2)，故不被ADP清除和氧化酶抑制劑所阻斷，因而被認為是誘導血小板聚集的第3條途徑。

許多嚴重危害人類健康疾病的發生發展與血栓形成密切相關。血管內皮損傷、血小板功能亢進、血液凝固性增高、纖溶活性降低、血液黏滯性增大、血流動力與流態條件變差等都是血栓形成的重要原因。血小板參與了血栓形成的整個過程，血小板的激活是血栓形成過程中很重要的始動因素。血管內皮細胞受到刺激(如凝血酶、緩激肽和組胺等)可合成和釋放PAF，PAF一方面通過激活血小板促進凝血酶和纖維蛋白生成，另一方面通過激活中性粒細胞造成血管內皮受損。PAF與血管內皮細胞、血小板等相互作用，在血栓形成過程中起著重要作用。近年臨床研究表明，中風患者服用抑制TXA2生成的藥物，可以改善缺血性腦血管病的癥狀，該藥物通過抑制血小板環氧化酶代謝而阻止血栓形成，但不能阻斷由于PAF引起的血小板的繼續活化，此乃中風難治的重要原因之一。基于這一原因，在中風治療時除考慮抑制TXA2、凝血酶、膠原等誘導血小板聚集的途徑外，抑制PAF誘導的血小板聚集對防止病理性血栓形成尤為重要。

補陽還五湯臨床應用廣泛，療效顯著，是目前中風等血栓性疾病治療應用頻率最高的方劑。中藥血清藥理學方法可在某種程度上克服中藥本身的理化因素對實驗結果的干擾，在中藥復方的藥理研究中具有極強的針對性。我們前期研究表明，補陽還五湯注射液體外給藥能明顯抑制家兔洗滌血小板PAF受體與放射配基的特異性結合，其特異結合抑制率與銀杏苦內脂B相似，但高濃度反而抑制作用減弱;補陽還五湯體內多次灌服給藥，能提高家兔洗滌血小板PAF受體與放射配基的特異結合量，其作用與銀杏葉提取物相似并高于空白組。本文研究發現，含補陽還五湯藥物血清能明顯增強抑制［3H］-PAF與家兔洗滌血小板PAF受體的特異結合，提示補陽還五湯含藥血清中某些活性成分有直接抑制［3H］-PAF與家兔洗滌血小板PAF受體特異結合的作用。同時，結合補陽還五湯注射液對PAF受體與放射配基的特異結合有雙向調節作用，以及從不含黃芪的補陽還五湯注射液對［3H］-PAF與家兔洗滌血小板PAF受體特異結合的抑制作用明顯強于補陽還五湯注射液來分析，補陽還五湯組方中的黃芪對該方抑制家兔血小板PAF受體活性作用有緩和作用，體現了補陽還五湯中配伍大劑量生黃芪以求“大補元氣，氣旺以促血行，祛瘀而不傷正”的配伍機制，這與本課題組前期對補陽還五湯拆方研究發現生黃芪在補陽還五湯中可降低活血藥對PAF受體結合作用的過強抑制，使整方抑制［3H］-PAF與兔血小板受體結合的作用緩和結果一致。而補陽還五湯含藥血清對［3H］-PAF與家兔洗滌血小板PAF受體特異結合的抑制作用弱于金納多藥物血清，這與金納多是銀杏葉提取物，其中的萜類成分為血小板PAF受體的特異拮抗作用有關。

補陽還五湯含藥血清可以明顯抑制［3H］-PAF與家兔洗滌血小板PAF受體的特異結合而達到抑制血栓形成的目的，但究竟含藥血清中哪種活性成分起關鍵作用，或是多種活性成分間的協同作用，尚待進一步研究。