銀杏內酯納米粒細胞毒性研究

蔣青鋒 陳志良 包 杰 劉喜榮 武金寶,4*

1 南方醫科大學附屬南方醫院藥學部（510515）

2 湖南玉新藥業有限公司（410007）

3 南方醫科大學附屬南方醫院檢驗科（510515）

4 包頭醫學院第二附屬醫院內蒙古消化病研究所（014030）

納米生物技術是國際生物技術領域的前沿和熱點問題，美國、日本、德國等國家均已將納米生物技術作為21世紀的科研優先項目予以重點發展。特別是納米藥物載體將來會在疾病的診斷、治療和衛生保健等方面發揮重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L929細胞株（南方醫科大學病理教研室提供），銀杏內酯（上海傲拓信息科技有限公司），胰酶，噻唑藍(MTT)和DMSO (購自Sigma公司)，培養基RPMI 1640 (Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青)，96孔和6孔細胞培養板（Corning公司，美國），酶標儀(GE，美國)，AU5421全自動生化分析儀(Olympus，日本)。

1.2 實驗方法

1.2.1 銀杏內酯納米粒的制備

采用表面聚合法制備銀杏內酯PELGE納米粒[1,2]。

1.2.2 實驗分組與試驗處理

實驗分銀杏內酯納米粒組（實驗組）、銀杏內酯藥物組（藥物對照組）、空白納米粒組（載體對照組）3組，分別用含10%胎牛血清RPMI-1640培養液溶解，按照試驗需要制備100、75、50、25和1 mg/L 5個濃度劑量組，0.22μm微孔濾膜過濾除菌備用。

1.2.3 L929細胞培養

細胞在含10%胎牛血清（56℃熱滅活30min）的RPMI-1640培養液中，置37℃，5%CO2孵箱中培養生長。細胞密度為1×109個/L，每1～2d傳代一次，取指數生長期細胞用于實驗。

表1 不同濃度銀杏內酯納米粒處理組對培養L929細胞LDH釋放的影響（n=3，±s）

表1 不同濃度銀杏內酯納米粒處理組對培養L929細胞LDH釋放的影響（n=3，±s）

組別對照組 100g/L 75g/L 50g/L LDH 活性(U/L) 25.00±1.00 26.67±1.15 26.00±1.00 25.33±1.15 1.405 0.311測定項目F P

表2 不同濃度銀杏內酯藥物（不含PBCA）處理組對培養L929細胞LDH釋放的影響（n=3，±s）

表2 不同濃度銀杏內酯藥物（不含PBCA）處理組對培養L929細胞LDH釋放的影響（n=3，±s）

組別對照組 100g/L 75g/L 50g/L LDH 活性(U/L) 25.00±1.00 26.00±1.00 26.33±2.08 25.67±0.58 0.583 0.642測定項目F P

表3 空白納米粒（PBCA）處理組對培養L929細胞LDH釋放的影響（n=3，±s）

表3 空白納米粒（PBCA）處理組對培養L929細胞LDH釋放的影響（n=3，±s）

對照組 100g/L 75g/L 50g/L LDH 活性(U/L) 25.00±1.00 26.00±1.00 25.00±1.00 24.67±1.15 0.923 0.472測定項目 組別F P

1.2.4 細胞存活率的測定

于96孔培養板接種L929細胞，每孔加入100μL，培養24h后，棄去原培養基，PBS液洗滌兩次，實驗組分別加入不同濃度的銀杏內酯納米粒、空白納米粒（PBCA）和銀杏內酯藥物（不含PBCA），對照組加入培養液。繼續培養2、4、7d，在各觀察期取出一塊培養板，每孔加入20μL MTT(0.5g/L)，孵化4h，吸去原液，加入150μL DMSO，置免疫酶標儀570nm 處測定吸光度，細胞生存率以百分率表示。按如下公式計算：

細胞生存率（%）=處理組A值/對照組A值×100%

1.2.5 乳酸脫氫酶（LDH）的釋放

將制備好的細胞懸液接種于6孔培養板：分為空白組（細胞對照組）及不同濃度劑量的實驗處理組，每組培養24h后，取細胞培養上清液于2000r/min室溫離心3min，于全自動生化分析儀上測定漏出細胞外的LDH活性。

1.2.6 統計學處理

2 結 果

2.1 L929細胞培養

在倒置的相差顯微鏡下觀察L929細胞系的生長情況，發現細胞呈梭形和多角形貼壁生長，具有典型的成纖維細胞的形態特征。細胞生長旺盛，約1d傳代一次，細胞活力很強（圖1）。

圖1 光學顯微鏡下L929細胞形態（×100）

2.2 不同濃度銀杏內酯藥物銀杏內酯納米粒和空白納米粒對L929細胞株生存率的影響

不同濃度銀杏內酯藥物、銀杏內酯納米粒和空白納米粒對L929細胞株的毒性采用MTT法判定，結果以細胞的存活率表示（均值±標準差）。在2、4和7d時間點測定各濃度劑量的銀杏內酯藥物、銀杏內酯納米粒和空白納米粒對L929細胞生長抑制作用是采用析因設計資料方差分析方法。析因方差分析結果顯示銀杏內酯藥物各劑量組間差異不具有顯著性（F= 1.590，P= 0.203）。各測量時間點間差異具有顯著性（F= 67.653，P= 0.000）。對細胞生長抑制作用顯著減弱，與高劑量組（10和5g/L劑量）相比差異極顯著（P＜0.01）。在4d，5g/L劑量處理組與低劑量（1和0.5g/L劑量）相比，差異不顯著（P＞0.05）。而10g/L劑量組與低劑量組差異顯著（P＜0.05）。在7d，高劑量組（10和5g/L）對L929細胞生長仍有一定的抑制作用，與低劑量組相比差異極顯著（P＜0.01）。在相同的測定時間點，細胞的生存率隨著銀杏內酯納米粒劑量的減少而增高。相同濃度的銀杏內酯納米粒對細胞的影響隨著細胞培養天數的增多而減少，組內差異均不顯著（P＞0.05）。

2.3 不同濃度銀杏內酯藥物、銀杏內酯納米粒和空白納米粒處理后L929細胞株LDH活性

經不同濃度（100、75和50g/L）的銀杏內酯藥物、銀杏內酯納米粒和空白納米粒處理后，L929細胞株培養液中LDH活性與空白對照組比較均有所升高，但差異不具顯著性（P＞0.05）（表1～表3）。提示各劑量組的上述3種藥物對L929細胞株均無明顯的細胞毒性。

3 討 論

銀杏內酯是一類有效的血小板活化因子受體拮抗劑，是治療心腦血管疾病的常用藥物[3-5]。當前市場上提供的銀杏藥物制劑有口服和靜脈給藥2種劑型，銀杏內酯銀杏的主要活性成分之一，其溶解吸收差，生物利用度不高，而且傳統給藥方式全身分布，靶器官和靶細胞血藥濃度低，達不到很好的治療效果[5,6]。為此，我們根據銀杏藥物內酯的作用機制，選擇合適的靶向性藥物載體研制出銀杏內酯納米粒，可將銀杏內酯有效成分靶向導入腦內。 通過銀杏內酯納米粒的細胞毒性研究，為進一步驗證其在腦內的分布、代謝、半衰期、生物效應奠定基礎。研究結果顯示，銀杏內酯納米粒與其藥物對照銀杏內酯及載體對照空白納米粒相比，細胞毒性無統計學意義，其細胞毒性僅為Ⅰ級，說明研制的銀杏內酯納米粒生物相容性好，可以進一步研究其藥效及藥理作用，提示銀杏內酯納米粒研制獲得了初步的成功。

[1]Olivier JC,Fenart L,Chauvet R,et al.Indirect evidence that drug brain targeting using polysorbate-80 coated polybutylcyanoacrylate nanoparticles is related to toxicity[J].Pharm.Res,1999,16(12):1836.

[2]Haun JB,Devaraj NK,Hilderbrand SA,et al.Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection[J].Nat Nanotechnol,2010 Aug 1. [Epub ahead of print].

[3]Li LY,Zhao XL,Fei XF,et al.Bilobalide inhibits 6-OHDA-induced activation of NF-kappaB and loss of dopaminergic neurons in rat substantia nigra.[J].Acta Pharmacol Sin,2008,29(5):539-547.

[4]楊本明,劉紅.銀杏葉制劑臨床應用新進展[J].中華醫學研究與實踐,2005,3(1):44-45.

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