丙型肝炎免疫層析診斷試劑研制和性能分析

蔣樹海 楊發(fā)青 Tony Lee 王朝南 孫樹葉 田 輝 王之嬰

全球約1.7億人感染丙型肝炎病毒（HCV），危害十分嚴(yán)重[1]。我國HCV的感染率約為3.2%，HCV抗體攜帶者達(dá)4千萬[2]。我國將HCV抗體檢查列為我國法定的血源性篩查項目。當(dāng)前最為常用的HCV抗體檢測方法是ELISA法，將C22-3、C33C、C100-3和NS5作為包被抗原，標(biāo)記抗人IgG進(jìn)行檢測[3]。免疫膠體金技術(shù)是新型的免疫學(xué)檢測方法，具有檢測簡便、穩(wěn)定性好、適于現(xiàn)場檢測等特點(diǎn)，但運(yùn)用免疫層析技術(shù)對HCV抗體檢測具有一定的技術(shù)難度。本文報道一種以雙抗原夾心膠體金法研制HCV抗體診斷試劑盒的方法，及其對臨床性能分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 HCV抗原：為HCV NS3、Core融合抗原，來自美國和軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，用于試劑的包被和標(biāo)記；氯金酸BSA，PEG20000，水解酪蛋白：Sigma試劑：Sigma試劑，NC膜：Millipore公司。其他常用試劑均為分析純試劑。

1.1.2 干擾樣本

包括高血脂、溶血、黃疸血清，含抗凝劑肝素、EDTA和枸椽酸鈉血漿，含相關(guān)傳染病抗體陽性血清，由本公司在相關(guān)醫(yī)院收集、驗證并保存，HCV抗體陰性。1.1.2 HCV抗體國家血清盤中國藥品生物制品檢定所研制。

1.1.4 HCV抗體ELISA試劑盒

1.1.5 臨床樣本 共581例，由中國藥品生物制品檢定所收集，為獻(xiàn)血員和HCV患者樣本。

1.2 方法

1.2.2 HCV重組抗原的包被

用0.01mol/L pH7.2 PBS將HCV重組抗原稀釋成適當(dāng)適當(dāng)濃度，噴膜包被，包被完成后將NC膜在干燥間干燥6～8h，備用。

1.2.1 HCV重組抗原的膠體金標(biāo)記

以氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，用K2CO3將溶液調(diào)到pH 8.0。按每1mL溶液加入10μg重組抗原將蛋白緩慢滴加到膠體金溶液中，繼續(xù)攪拌1h，再以BSA和PEG20000進(jìn)行封閉，離心，棄上清，沉淀按原體積復(fù)溶至膠體金稀釋液中。然后將標(biāo)記膠體金溶液涂抹在無紡布載體上，制成膠體金墊。按同樣方法標(biāo)記鼠IgG，制備的鼠IgG膠體金墊用于試劑質(zhì)控。

1.2.3 試紙組裝

在干燥間內(nèi)準(zhǔn)備好吸水濾紙、PVC板、上樣墊、在PVC板帖包被好的NC膜，NC膜下緣粘貼膠體金墊，膠體金墊下緣粘貼上樣墊，NC膜上緣粘貼吸水濾紙，再切成4mm寬的試紙條。密封于鋁箔袋中，組裝成成品。

1.2.4 性能分析評估

建筑勞務(wù)企業(yè)作為推動我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要支柱之一，理所當(dāng)然應(yīng)當(dāng)受到國家的高度重視。為了推動建筑勞務(wù)企業(yè)的發(fā)展，國家應(yīng)當(dāng)緊跟時代步伐，不斷完善建筑相關(guān)的法律法規(guī)，從而規(guī)范建筑勞務(wù)企業(yè)可能出現(xiàn)的種種不良行為，并為他們提供相應(yīng)的發(fā)展方向。建筑勞務(wù)企業(yè)也應(yīng)當(dāng)在滿足法律法規(guī)的前提下，制定符合自身發(fā)展需要的內(nèi)部規(guī)章制度，從而為自身的發(fā)展提供制度保障。建筑勞務(wù)企業(yè)可以建立內(nèi)部激勵機(jī)制、質(zhì)量保障機(jī)制以及實(shí)名制管理等，這些制度的建立都能夠有效提高工作效率以及工作質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)自身的可持續(xù)發(fā)展。

將公司保存的含不同抗凝劑肝素、EDTA和枸椽酸鈉血漿，高血脂、溶血、黃疸血清；關(guān)傳染病HAV、HIV、HBV、HP和TP抗體陽性血清取出，用試劑進(jìn)行檢測。

1.2.5 穩(wěn)定性分析

①將快速診斷試劑置于37℃、50℃條件下，每隔7d取出部試劑，進(jìn)行測試。②將快速診斷試劑在室溫條件下保存。③在實(shí)際保存狀態(tài)下每天至6個月取出試劑，進(jìn)行測試。

1.2.6 國家參考品血清盤的檢測

取出HCV抗體國家參考品，平衡到室溫后，將快速診斷試劑條平放，在上樣墊上滴加50～100μL被檢測樣品，在30min根據(jù)檢測線是否出現(xiàn)判定結(jié)果。

1.2.7 臨床樣本分析

581份臨床樣本同時用Ortho、Murex和Sorin 3種ELISA試劑和快速診斷試劑進(jìn)行檢測，計算并統(tǒng)計本試劑的臨床性能。

2 結(jié) 果

2.1 分析特性能

檢測結(jié)果試劑對高血脂、溶血、黃疸血清檢測均為陰性；HAV、HBV、HIV、TP和HP抗體陽性樣本；不同抗凝劑測均為陰性，對以上物質(zhì)沒有非特異性反應(yīng)。

2.2 穩(wěn)定性分析

在室溫條件下，6、9、12、18個月檢測均能通過HCV國家血清盤測試。37℃條件共檢測到6周，50℃條件下共檢測到3周，均能通過HCV國家血清盤測試。根據(jù)加速破壞試驗結(jié)果，快速診斷試劑的穩(wěn)定性較好，室溫條件下穩(wěn)定性達(dá)到18個月。

2.3 國家血清盤檢測

以國家參考品作為樣品進(jìn)行測試，檢測結(jié)果和規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)完全一致，并且敏感度樣本全部檢出，見表1。

2.4 對臨床樣本分析

表1 快速診斷試劑對HCV抗體國家血清盤測試

對581份臨床樣本進(jìn)行檢測，均檢測出樣本中有300份以上的HCV抗體陽性樣本，但并不完全一致，見表2。

表2 4種試劑對臨床樣本HCV抗體的檢測結(jié)果

3種試劑間共有61份樣本存在部分檢測結(jié)果不一致現(xiàn)象，相互間的符合率為91%至96%。

由于單個試劑可能存在一定的假陽性和假陰性，以3種ELISA試劑中的2種檢測一致結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)分析更能反應(yīng)樣本的真實(shí)情況，對比分析，統(tǒng)計結(jié)果如下，見表3。

表3 2種ELISA試劑一致檢測結(jié)果和本試劑對比分析結(jié)果

3 討 論

HCV抗體檢測一直存在難度，需要檢測抗多種抗體聯(lián)合包被以提高檢測的敏感度[4]。多種診斷用抗原增加了試劑研制的復(fù)雜性，對于HCV抗體快速診斷試劑成功的研究報道有限。HCV抗體診斷ELISA試劑由于的Core抗原的特殊性，雖然已發(fā)展到第3代，但一直采用間接法進(jìn)行檢測。由于蛋白和膠體金的標(biāo)記為物理吸附[5]，所以抗原可能和膠體金標(biāo)記并保持其活性，實(shí)現(xiàn)雙抗原夾心法快速檢測。雙抗原夾心法存在兩次特異性抗原－抗體的結(jié)合，同時雙抗原夾心法能檢測出樣本中IgM，亦能增加檢測的敏感度，特別對于HCV，IgM經(jīng)常出現(xiàn)[6]。

本研究采用了雙抗原夾心法對HCV抗體進(jìn)行檢測。研究過程中經(jīng)不斷試驗和優(yōu)休。對國內(nèi)外數(shù)個不同來源抗原進(jìn)行篩選，最后得到了理想的抗原和工藝技術(shù)，研制出理想的試劑，性能穩(wěn)定性良好。臨床樣本分析表明，和高質(zhì)量ELISA相比，陰性符合率為97.4%，陽性符合率為96.5%，說明研制的快速診斷試劑和ELISA無顯著性差異，性能相似。由于免疫快速診斷試劑具有穩(wěn)定性好檢測方便、快速等特點(diǎn)，高性能的HCV抗體免疫快速檢測試劑和ELISA試劑互補(bǔ)，能在臨床上特別是中小醫(yī)院得到廣泛運(yùn)用，輔助診斷丙型肝炎，具有重要的社會意義。

[1] Baldo V,Baldovin T,Trivello R,et al.Epidemiology of HCV infection[J].Curr Pharm Des,2008,14(17)：1646-1654.

[2] 彭劼.慢性丙型肝炎的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2008,37(3)：5-7.

[3] Roggendorf M,Lu M,Meisel H,et al.Rational use of diagnostic tools in hepatitis C [J].Hepatol.1996,24(2 Suppl)：26-34.

[4] Chen M,Sallberg M,Sonnerborg A,et al.Limited humoral immunity in hepatitis C virus infection [J].Gastroenterology,1999,116(1)：135-143.

[5] Nikki R.Immunogold conjugation for IVD applications[J].IVDT,2002,8(3)：33-36.

[6] Nikolaeva LI,Blokhina NP,Tsurikova NN,et al.Virus-specific antibody titers in different phases of hepatitis C virus infection [J]. J Viral Hepat,2002,9(6)：429-437.