奶牛單基因遺傳缺陷研究進展

周月君

(西北農林科技大學動物科技學院,陜西楊凌712100)

家畜遺傳缺陷是指由于遺傳物質變異對家畜個體造成的有害影響,表現為身體結構缺陷或功能障礙。在過去50年里,由于有效地應用基于數量遺傳學的育種方案,家畜生產力得到了大幅的提高。高強度的選擇,加上人工授精技術的普及和應用,極大地增加了家畜養殖的效益,但隨之而來的是,畜群的近交系數逐漸增大,畜群有效含量逐漸減小。全世界存在有幾億頭奶牛,而群體有效含量只有幾百頭,奶牛業面臨著遺傳缺陷病的定期暴發。

由于遺傳物質變異對家畜個體造成的有害影響,表現為身體結構缺陷或功能障礙,這種有害的遺傳信息按照一定的遺傳方式在世代間垂直傳遞,在某些品種的家系內呈現一定的表達方式,不會延伸到無親緣關系的個體中。家畜育種中,尤其是在以人工授精技術廣泛應用的奶牛育種中,識別并淘汰造成遺傳病的有害基因尤為重要。

1 遺傳缺陷的危害

有效群體數的降低導致近交程度的增加,使得畜牧業面臨著隱性缺陷病的定期暴發。例如,在上世紀90年代,14%的公牛攜帶編碼白細胞 整合素亞單位CD18基因的突變,從而引起白細胞黏附缺陷(BLAD)。這一致死的免疫缺陷使得0.2%的新生犢牛死亡,估計每年給美國造成的經濟損失為5億美元。而近期發現25%的公牛是脊椎畸形綜合癥(CVM)的攜帶,該突變基因純合時造成93%的母牛流產,給世界奶牛業造成了巨大損害。由于大多數遺傳缺陷病均為隱性遺傳,而攜帶者表現正常,因此很難發現。當某種遺傳缺陷被發現時,其已經在畜群中進行了長時期的傳播,這給養殖帶來巨大的損失。如CVM 的最初攜帶者出生在1974年,是當時一頭非常優秀的種公牛,但發現該病的時間是2000年,這已經過了26年,其所造成的直接經濟損失是巨大的。而遺傳缺陷病一旦發生,對疾病的診斷和控制、隱性攜帶者的檢出和淘汰、育種方向的改變及育種計劃的調整等都需要花費大量的人力和物力,造成不可估計的間接經濟損失。而有害基因污染已有優良基因庫,由此造成損失更不容忽視。

2 單基因遺傳病的發病機理及遺傳規律

遺傳缺陷病的發病機理是由于調節機體內發育及代謝通路的遺傳物質發生變異,使通路的某個環節受阻,從而引進機體結構異常或功能的損害。如白細胞粘附缺陷癥(Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency,BLAD)是一種牛的造血系統遺傳性疾病,以嚴重的重復性感染、缺少膿液形成、損傷愈合延遲和白細胞增多癥為特癥,實質是白細胞粘附及相關的功能包括吞噬和趨化作用的缺陷。遺傳缺陷具有先天性和家系遺傳的特癥,遵循孟德爾遺傳規律向后代傳遞。對于占大部分的隱性遺傳缺陷而言,由于等位基因(Aa)的顯隱性關系,雜合子不會表現發病。但如果表型正常的攜帶者(Aa)交配產生表型正常與缺陷純合個體的比為3∶1,后代基因型AA 、Aa、aa個體的比例為 1∶2∶1,也就是 50%個體為攜帶者,如果在胚胎時期aa個體流產或出生時即死亡,那么后代攜帶者為2/3,也就是67%的個體為攜帶者。其它的遺傳方式有顯性、不完全顯性和超顯性,同樣可用孟德爾理論進行解釋。

3 奶牛常見的遺傳缺陷

到目前已報道的牛遺傳缺陷共有376種,其中鑒定為單基因遺傳的共有75種,已闡明分子機制的有43種,作為人類疾病潛在模型的126種。其他家畜遺傳缺陷情況見表1。而國際荷斯坦牛聯盟(World Holstein-Friesian Federation,WHFF)及加拿大荷斯坦奶牛協會要求在系譜標明的有6種遺傳缺陷,包括牛白細胞粘附缺陷、脊椎畸形綜合癥、尿苷酸合酶缺陷癥、并趾癥(也稱為螺蹄癥)、瓜氨酸血癥、凝血因子XI,其染色體位置及在系譜上的標識見表2。下面就以上6種遺傳缺陷情況作一簡述。

表1 家畜遺傳缺陷匯總表

3.1 脊椎畸形綜合癥

脊椎畸形綜合癥(complex vertebral malformation,CVM)最早由丹麥科學家于2001年發現[1]。最初丹麥科學家發現荷斯坦牛群中存在脊椎畸形,兩前腿筋腱變短、無法直立行走,頸短、心臟畸形等綜合癥狀的新生病畜,并且發現牛群中流產率偏高。經DNA鑒定發現了一個隱性遺傳缺陷基因,其純合時可以造成妊娠母牛流產、死胎或犢牛出生后很快死亡。隨后美國、加拿大、日本和歐洲一些國家也相繼報道[2],隨后建立了DNA分子檢測方法。系譜研究發現,所有發病個體均可以追溯到美國一頭非常著名的公牛“Carlin-M Ivanhoe Bell”(登記號:1667366),這頭公牛可能是該遺傳缺陷基因的共同祖先,出生在1974年,其父親 Penstate Ivanhoe Star,出生在1963年,被認為是變異源,從系譜標識上看出,他們同時是BL的攜帶者。Carlin-M Ivanhoe Bell在當時因其極優良的生產性能而在全世界范圍內被廣泛使用,致使20幾年后他所攜帶的隱性有害基因得到廣泛傳播。在種公牛中,美國、德國、瑞典、日本CVM攜帶者頻率分別為17.76%,13.17%、23.25%和32.50%,英國排名前100名的公牛攜帶者頻率為16%。我國,2006年初芹對68荷斯坦種公牛進行了檢測發現10頭攜帶者[3],計算頻率為14.71%。脊椎畸形綜合癥造成胎兒的早期流產、死胎或早產,只有極少數個體出生時還能夠存活一段時間,但很快死亡或被淘汰。據統計,在母牛妊娠的100 d內,患CVM 的胚胎的流產率是29%;當妊娠到150 d時,流產率上升到45%;當妊娠260 d時,有77%的CVM 胎兒已經死亡,而整個妊娠期能存活的CVM胎兒僅有7%,實際出生時犢牛的存活率可能更低[4,5]。CVM遺傳缺陷的發現立刻引起了各國奶牛育種協會和育種工作者的重視。當前該遺傳缺陷病已經得到了控制,如在加拿大2002年和2003年出生的犢牛攜帶頻率為2.5%,當前荷斯坦母牛中攜帶頻率為1.67%。

表2 6種遺傳缺陷染色體位置及在系譜上的標識

3.2 白細胞粘附缺陷癥

白細胞粘附缺陷癥(bovine leukocyte adhesion deficiency,BLAD),最早在1983年發現,1984年確定病因,它是一種與白細胞粘附有關的細胞表面糖蛋白(整合素)的表達缺陷所致。多發生于1～14個月齡的荷斯坦牛,是常染色體單基因隱性遺傳類型,雙親均可作為缺陷的攜帶者。出生小牛如為本病的純合體,臨床上即顯癥發病,表現為持續性或反復感染發炎、生長發育受阻、嗜中性粒細胞持續性增加等癥狀。Shuster等對1頭患 BLAD的 Holstein牛CD18編碼基因進行了序列分析,結果發現,383位的堿基由A變為G(A383G),與之相應的位于胞外高度保守區的128位的天門冬氨酸變成了甘氨酸,致使白細胞表面的整合素表達明顯減少或缺乏而引起臨床發病。另1個堿基則發生T775C變異,但其對應的氨基酸都是亮氨酸,故不發病。牛的CD18基因已經被定位在1號染色體上,GENBANK中牛CD18DNA序列全長為1640bp(Y12672)[6]。BLAD攜帶者的共同祖先是“Osborndale Ivanhoe”(注冊號 :1189870),出生在 1952年,其兒子 “Penatate Ivanhoe star”(注冊號:1441440),出生在 1963年,孫子“Carlin-M Ivanhoe Bell”(注冊號:1667366),出生在1974,均為攜帶者,同時后兩者還是CVM的攜帶者。美國2025頭荷斯坦公牛中發現BLAD攜帶率為14.1%,其中TPI排名前100名的公牛BLAD攜帶率高達17.1%。據估測,美國每年可以出生1.6萬頭BLAD牛,每頭母牛按300美元計,每年引起的經濟損失可達50萬美元。2002年,韓國對109頭荷斯坦公牛進行了檢測,發現 5頭BLAD攜帶者[7]。2003年,烏拉圭在121頭母牛中發現8頭BLAD攜帶者,17頭公牛中發現 2頭 BLAD攜帶者[8]。2004年,波蘭對5785頭公牛進行了檢測,其中198頭為BLAD攜帶者,盡管之前曾采取了一定的措施,但仍發現了攜帶者[9]。同年,捷克檢測了246頭牛,沒有發現BLAD攜帶者。在加拿大,1992年出生的牛攜帶者頻率達到5%,當前牛群中BLAD攜帶頻率為1.28%,已經得到了控制。

3.3 尿苷酸合酶缺乏癥

牛尿苷酸合酶缺乏癥(deficiency of uridine monophophate synthase,DUMPS),也稱為單普病,是荷斯坦牛群中一種常染色體單基因隱性遺傳疾病,可導致隱性純合的后代胚胎早期死亡。Schwenger B(1993)等人發現雜合子C-末端405處的密碼子存在一個點突變,原編碼精氨酸的密碼子CGA轉變為終止密碼子的 TGA[10]。突變基因的轉錄產物最終翻譯成一段C-末端缺失76個氨基酸催化亞基的短蛋白,造成乳清酸轉化為鳥苷酸的催化功能喪失,不能合成DNA、RNA所需的嘧啶核苷酸,從而導致胚胎在妊娠40～60 d時死亡,死亡率100%。UMP基因的cDNA序列全長為1869bp(NM 177508)。DUMPS攜帶者的共同祖先是“Skokie Sensation Ned”(注冊號:1308101),出生在1957年。該病上世紀80年末期才被發現。在我國,張松(1999)應用PCR-RFLP方法對北京市奶牛中心良種場(91頭)、北京市南郊杜慶牛場(82頭)、北京市南郊德茂牛場(190頭)共363頭中國荷斯坦奶牛和烏魯木齊種牛場的193頭新疆褐牛以及北京市種公牛站的59枚公牛凍精進行了尿苷酸合酶(UMPS)基因分子水平的檢測。結果檢出了2頭雜合母牛,雜合子占所檢測母牛群的0.551%,此頻率處于國外報道的DUMPS發生頻率的范圍(0.2%～2.5%)之內。在荷斯坦公牛和新疆褐牛中只檢測到一種基因型,沒有發現隱性突變基因的攜帶者。在加拿大當前DUMP的攜帶者頻率為0.068%,基因頻率很低,可以認為已經從牛群中根除。

3.4 瓜氨酸血癥

瓜氨酸血癥(citrullinemia,CN)是一種引起荷斯坦牛尿循環代謝紊亂的常染色體單基因隱性遺傳缺陷病。發病個體由于缺乏尿素代謝過程中催化瓜氨酸生成精氨酸琥珀酸的關鍵酶-精氨酸琥珀酸合成酶,而導致瓜氨酸不能轉變為精氨酸琥珀酸,引起機體內尿代謝紊亂。這一代謝紊亂的發生使體內代謝生成的瓜氨酸前體-氨無法轉變為尿素,而無法排出體外,從而使對機體有毒物質的氨大量積蓄于組織及血液中,引起機體發病。由于母體可以排出胎兒代謝產生的氨,所以發病個體在胎兒期間或剛出生時表現正常,但出生后不久便表現出一系列臨床癥狀,如精神沉郁、步態紊亂、抽搐、驚厥、失明、虛脫等,一般出生后5 d死亡,死亡率100%。該病是精氨酸琥珀酸合成酶基因的一個點突變造成的。精氨酸琥珀酸合成酶外顯子5發生C-T的點突變,使密碼子CGA轉變為終止密碼子TGA,從而其翻譯產物-精氨酸琥珀酸合成酶變成了截短了的85個AA的蛋白質(正常為412個AA),而失去活性[11]。Dennis根據此原理利用限制性內切酶AvaII建立了檢測遺傳缺陷CN的 PCR-RFLP方法,之后Robinson利用該方法對美國荷斯坦牛進行了檢測。澳大利亞荷斯坦牛群中CN攜帶頻率曾經很高,1989年澳大利亞人工授精組織的13%公牛是遺傳缺陷CN的攜帶者,所有攜帶者均與公牛“Linmack Kriss King”(注冊號:CAN294213)有關,Linmack Kriss King出生在1959年,被認為是CN攜帶者的共同祖先,與同時代的其他公牛相比,具有極高的遺傳潛能,尤其是乳脂量育種值高,受到育種者及生產者的廣泛歡迎。這使CN在荷斯坦牛群中廣泛傳播。到80年代,澳大利亞主要育種公司的75%公牛含有Linmack Kriss King的血液。1900年澳大利亞禁止CN攜帶者公牛進入人工授精中心,使該病的發生率明顯降低。在加拿大奶牛協會網上(www.cdn.ca),共查到公牛Linmack kriss king的后代452頭,均出生在20世紀70～80年代,其中澳大利亞有63頭,法國8頭,英國 213頭,愛爾蘭40頭,新西蘭128頭。以英國出生的后代最多,并且在英國其后代有兩頭公牛參加國際公牛遺傳評定。在當前牛群CN攜帶者的頻率已很低,有的國家甚至檢測不到。

3.5 凝血因子XI缺陷癥

凝血因子XI(Factor XI,FXI)是一種絲氨酸蛋白酶原,在傳統的內源性凝血途徑中,因子XI被活化的因子XII激活后,在鈣離子存在下,被激活,從而引發凝血過程的進行。近來研究發現,因子也能被凝血酶激活,活化的因子XI促進凝血酶的大量產生,近一步激活被凝血酶激活的纖溶抑制物,而抑制纖溶系統,起到凝血和抗凝作用。FXI主要在內源性凝血的前期反應中對相關因子的激活起關鍵性的作用。缺陷個體一般無直接表現癥狀,間接癥狀包括:注射治療時出血時間延長、血腥奶、貧血,與血友病有些相似。缺陷純合及雜合個體可能表現低的產犢率和成活率,并且對疫病的易感性。酶活試驗發現感染個體FXI活性比正常個體低10%。對奶牛養殖具有重大的經濟影響。FXI缺陷病已經在人類、狗和牛中相繼報道,最早是在1969年的美國,后來在加拿大和英國。FXI基因包括15外顯子和14個內含子,定位在牛 27q14。Marron et al(2004)在荷斯坦牛群中發現感染個體FXI基因的第12外顯子上存在一個76 bp的插入突變,導致一個終止密碼子的出現,使翻釋后的FXI因子缺乏蛋白功能區[12]。并對美國419個荷斯坦牛進行了檢測,結果檢測出 5個雜合子,突變頻率為1.2%。Kunieda et al(2005)在日本黑牛群體中發現感染個體在第9外顯了上存在一個15bp的插入突變[13]。目前在加拿大還沒有進行分子檢測,沒有確定共同祖先。

3.6 并趾癥

牛并趾癥(syndactyly),也稱為騾蹄癥(Mulefoot,MF),是一種常染色體的隱性遺傳病,但在不同品種中表現不同的外顯率,感染者一般一只或多只蹄子均可表現騾蹄。最早報到在1967年,到目前已經在多個國家的許多個品種中報到,然而大部分的文獻都是發生在美國荷斯坦牛中。早期的研究發現,并趾癥攜帶者可多產2.1磅的乳脂,298磅的奶量。1996年Charlier用基因組范圍內的標記進行IBD連鎖分析將該基因定位到牛15號染色體上。Duchesne(2006)對36個患有騾蹄癥的荷斯坦母牛進行了研究,發現所有感個體的低密度脂蛋白受體結合蛋白基因(Low Density Lipoprotein Receptorrelated Protein 4,LPR4)第33外顯子發生了兩個連續堿基的突變(C4863A,G4864T),導致LRP4蛋白的兩個遺傳密碼發生發改變,改變了保守性的類表皮樣生長因子蛋白的結構。Johnson(2006)在兩頭感染的安格斯牛LRP4基因的第37內含子上發現了一個不同的單堿基突變。Cord Dr?gemǜller(2007)在荷斯坦牛、德國西門塔爾牛和西門塔爾-夏洛來牛的 LRP4基因上發現4個新的突變[14]。騾蹄癥攜帶者的共同祖先是“Wayne Spring Fond Apollo”(注冊號:159582),出生在 1970 年,曾經是金牌公牛。系譜分析發現該公牛是“Osborndale Ivanhoe”(注冊號:1189870)的孫子 ,而“Osborndale Ivanhoe”是BLAD攜帶者的共同祖先。在加拿大荷斯坦牛群中MF的攜帶者頻率為0.364%。

總之,大量的研究發現,隨著人們對高產的不斷追求,動物對疾病的抵抗力減弱,如高產奶牛乳房炎的發生率增加;同時,新的遺傳缺陷也在不斷的出現,如Carole CHarlier(2008)利用覆蓋全基因組的高密度的SNP芯片,對牛的5個遺傳缺陷進行了研究,精細定位了其中的3個遺傳缺陷:比利時蘭牛先天性肌張力障礙I和II,意大利契安尼娜牛魚鱗病胎兒,并闡明了分子機理[15]。有些遺傳疾病還與生產性能緊密連鎖,如Weaver綜合癥與奶牛產奶性狀間顯著相關。這使許多國家都把對奶牛的抗病性選擇納入育種規劃中。

在奶牛育種中,應監測所出現的遺傳缺陷,并收集發病個體的樣品,定位并鑒定突變位點,尋找診斷的標記,利用這些標記避免風險選配,進而通過有效的策略來控制遺傳缺陷病的暴發是至關重要的。在我國奶牛育種中也應加強這方面的工作,隨著我國奶牛群體的不斷擴大,檢測牛群的缺陷基因并淘汰缺陷個體,尤其是對種公牛而言,更是具有十分重要的意義。

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