冷凍溫度對牛精子復(fù)蘇率及降溫速率變化規(guī)律的研究

鄧福金,吳慶榮,王化青

(1.遼寧省畜牧業(yè)經(jīng)濟管理站,遼寧沈陽110032;2.遼寧省農(nóng)村發(fā)展研究中心,遼寧沈陽110032)

自二十世紀(jì)五十年代英國人Polge和Smith發(fā)現(xiàn)了甘油對精子的保護作用,并使精液冷凍技術(shù)獲得成功以來,在牛冷凍精液生產(chǎn)上已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用,并且取得了較高的受胎率。但是近些年來,牛精液冷凍技術(shù)進展緩慢,雖然在精液冷凍方法、稀釋方法和稀釋液配方等方面不斷加以改進,使冷凍精液精子復(fù)蘇率有所提高,但變化不大,主要原因是缺乏對精子復(fù)蘇規(guī)律的研究[1]。

精液冷凍時,冰晶首先在細(xì)胞外的保護液中形成,大約在-10℃以上,細(xì)胞內(nèi)的水仍不結(jié)冰,但變得愈益過冷。當(dāng)繼續(xù)降溫時,加快細(xì)胞外水的冰晶形成,而在未結(jié)冰的水中,溶質(zhì)的濃度越來越高。這就使細(xì)胞內(nèi)過冷溶液和細(xì)胞外愈益變濃的溶質(zhì)之間的化學(xué)勢出現(xiàn)巨大差異[2],要消除這種差異主要取決于精液的降溫速率。本試驗從冷凍溫度的選擇,研究冷凍溫度對精子復(fù)蘇率的影響及精液降溫速率變化規(guī)律,達到提高精子復(fù)蘇率的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用本站5頭種公牛精液,法國卡蘇公司生產(chǎn)的無動物源性稀釋液,法國大歐公司生產(chǎn)的 0.25 mL細(xì)管。日本Olympus BX41型生物相差顯微鏡及顯視系統(tǒng),日本富士平工業(yè)株式會社生產(chǎn)的TSM-160MHS型電腦程控冷凍儀及FA113型低溫平衡柜,北京宇時技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)的MCT-200型自動數(shù)字測溫儀,鉆石牌血球分類計數(shù)器。

1.2 試驗方法

試驗采用優(yōu)選法[3]確定精液冷凍溫度點。每個冷凍溫度點試驗程序相同,根據(jù)精液在每個冷凍溫度點冷凍后精子復(fù)蘇率情況,找出精液適宜冷凍溫度范圍及降溫速率,并根據(jù)測溫數(shù)據(jù)繪制出精液適宜降溫變化曲線。每次冷凍6支細(xì)管精液,將測溫儀探頭置于其中一支細(xì)管精液中固定,用于測定冷凍過程中細(xì)管內(nèi)精液溫度變化,另外5支細(xì)管精液每頭牛各1支。精液冷凍前要擺放在冷凍架上,置于+4℃平衡柜中降溫平衡。

表1 不同冷凍溫度精子復(fù)蘇率變化

1.3 試驗程序

冷凍前,將冷凍儀溫度調(diào)至所需要的冷凍點溫度[4],測溫儀自動記錄間隔時間設(shè)置為10 s。冷凍時,取出平衡柜中準(zhǔn)備好的精液樣品同冷凍架一起迅速放入冷凍儀中,關(guān)閉冷凍儀上蓋,同時打開測溫儀報警和記錄按鈕,測溫儀按照預(yù)先設(shè)定的時間間隔自動報警并記錄每一時刻的溫度,當(dāng)精液溫度降至試驗所設(shè)置的溫度時,向冷凍儀內(nèi)噴入液氮,至精液溫度降至-130℃以下時,取出樣品精液投入-196℃液氮中待檢。

1.4 精子活率評定方法

活率是指精液中直線前進運動精子數(shù)占精子總數(shù)的百分率。精子活率評定采用死活染色法[5],即取1滴精液,滴入盛有1～1.5 mL 1%剛果紅染色液中,于37℃溫度下浸染15 min,鏡檢前取1滴浸染后的精液和1滴5%苯胺蘭染色液混合復(fù)染,涂片晾干后在400倍顯微鏡下觀察,死精子著紅色,活精子不著色,每個片子至少觀察200個以上精子,根據(jù)死活精子數(shù)量計算精子活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同冷凍溫度對精子復(fù)蘇率的影響

從表1可以看出,精液在-98℃冷凍精子復(fù)蘇率最高,為73%。精液遠離-98℃冷凍精子復(fù)蘇率下降。精液在-86～-118℃范圍冷凍精子復(fù)蘇率較高,為65%。精液在-86～-118℃范圍外冷凍,精子復(fù)蘇率明顯下降。

2.2 精液降溫速率變化規(guī)律

從圖1可以看出,精液冷凍過程降溫速率不是勻速的,在 +4～-10℃范圍,平均降溫速率為7℃/min;在-10～-80 ℃范圍,平均降溫速率為35℃/min;在-80～-130℃范圍,平均降溫速率為 7℃/min。精液在-10～-80℃平均降溫速率(35℃/min)與精液在-98℃降溫速率(32.5℃/min)十分接近,說明精液發(fā)生相變階段適宜的降溫速率是提高精子復(fù)蘇率的關(guān)鍵。

圖1 精液適宜降溫變化曲線

3 討論

1)當(dāng)精液在較低溫度冷凍時,細(xì)胞內(nèi)的水先形成冰晶,由于形成的冰晶對細(xì)胞產(chǎn)生機械損傷,從而造成精子死亡;當(dāng)精液在較高溫度冷凍時,細(xì)胞外的水先形成冰晶,由于形成冰晶產(chǎn)生溶液效應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞脫水、蛋白質(zhì)變性,同樣造成精子死亡;當(dāng)精液在適宜溫度冷凍時,液體結(jié)晶、細(xì)胞脫水之間接近于合適的關(guān)系,對細(xì)胞造成的損傷最小,有利于冷凍后精子復(fù)蘇。因此,通過控制精液冷凍溫度能有效提高精子復(fù)蘇率。

2)影響精液降溫速率的因素主要取決于冷凍溫度和每次冷凍細(xì)管精液的數(shù)量。冷凍溫度越高、冷凍細(xì)管精液數(shù)量越多,精液降溫速率越慢;冷凍溫度越低、冷凍細(xì)管精液數(shù)量越少,精液降溫速率越快。使用自制冷凍槽或廣口液氮罐冷凍細(xì)管精液,通過調(diào)整冷凍架與液氮面之間的距離來控制精液的冷凍溫度,冷凍溫度一般控制在-120～-140℃之間,冷凍時溫度回升不得高于-90℃[6]。

3)細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成和細(xì)胞外溶液效應(yīng)與精液的降溫速率之間各為正負(fù)相[7],這就使精子活率與精液降溫速率之間的相關(guān)曲線呈“V”字形。當(dāng)精液以較快的速率降溫時,細(xì)胞內(nèi)形成冰晶的可能性是1,精子由于受到機械性損傷而死亡;當(dāng)精液以較慢的速率降溫時,細(xì)胞內(nèi)形成冰晶的可能性是0,精子可能被溶液效應(yīng)所致死。所謂最適宜降溫速率是使細(xì)胞內(nèi)形成冰晶的可能性和細(xì)胞外溶液效應(yīng)都降低到最低程度。

4 結(jié)論

1)精液在不同的溫度下冷凍,其精子復(fù)蘇率是不同的。試驗結(jié)果表明,精液在-98℃冷凍,精子復(fù)蘇率最高;在-86～-118℃范圍冷凍,精子復(fù)蘇率較高;遠離-86～-118℃范圍冷凍,精子復(fù)蘇率明顯下降。

2)精液冷凍過程的降溫速率是不同的。相變前,精液平均降溫速率比較緩慢為7℃/min;相變過程精液降溫迅速,平均降溫速率為35℃/min;相變后,精液降溫速率又開始緩慢,平均降溫速率為10℃/min[8]。精液冷凍成敗的關(guān)鍵是控制精液發(fā)生相變階段的降溫速率。

[1]沈家森,童孚中.公牛繁殖技術(shù)資料匯編[C].南京:農(nóng)業(yè)部牛冷凍精液質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心,2005,1.

[2]張堅中,徐鐵錚.家畜冷凍精液[M].北京:中國農(nóng)業(yè)科技出版社,1988.

[3]王元, 楊德莊.華羅庚的數(shù)學(xué)生涯[M].北京:北京科學(xué)出版社,2000.

[4]張儒學(xué).有效控制精液冷凍初凍溫度的方法[A].全國第七次動物繁殖學(xué)術(shù)討論會論文摘要匯編[C].廣州:中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物繁殖學(xué)分會,1993.P27.

[5]楊學(xué)時,同廣輔.全國牛冷凍精液國家標(biāo)準(zhǔn)培訓(xùn)班技術(shù)輔導(dǎo)教材[M].吉林:中國農(nóng)業(yè)出版社,1985,7.

[6]陳偉生,等.牛冷凍精液生產(chǎn)質(zhì)量管理手冊[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2006,9.

[7]董偉.細(xì)胞低溫生物學(xué)的基本問題[A].第九屆國際家畜繁殖會議論文[C].1981,6,P.38-40.

[8]鄧福金,等.牛細(xì)管精液冷凍溫度曲線的研究[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2006(12):10-12.