高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中地西泮及其代謝物殘留量

錢曉東，于慧娟，惠蕓華，金高娃，馮 兵，沈曉盛

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090）

地西泮又稱安定，是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)鎮(zhèn)靜劑，主要用于人和動(dòng)物鎮(zhèn)靜、催眠、癲癇的治療；畜牧生產(chǎn)中作動(dòng)物抗應(yīng)激的藥物，除此之外亦被大量非法用作動(dòng)物增重促進(jìn)劑。去甲地西泮、奧沙西泮和替馬西泮與地西泮具有相類似的作用，是地西泮在肝臟的主要代謝產(chǎn)物，并且也都已發(fā)展為臨床常用鎮(zhèn)靜劑。近年來，一些不法分子擅自在水產(chǎn)品飼養(yǎng)、捕撈和運(yùn)輸過程中使用這幾種鎮(zhèn)靜劑，造成了其在水產(chǎn)品中殘留。當(dāng)正常人攝入這些藥物后，肝臟負(fù)擔(dān)加重，頭腦長期昏昏沉沉，記憶受影響，同時(shí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)和肌肉功能受到抑制。農(nóng)業(yè)部235號公告中將地西泮規(guī)定為“允許作治療用，但不得在動(dòng)物性食品中檢出的藥物”。

目前，國內(nèi)外已報(bào)道的地西泮及其代謝物的測定方法有HPLC、HPLC-MS/MS、GC-MS、GC-ECD、固相萃取–紫外導(dǎo)數(shù)光譜檢測、TLCUV、酶聯(lián)免疫法等。HPLC、TLC等方法受靈敏度限制，無法滿足目前殘留分析檢測的要求。HPLC-MS/MS作為目前報(bào)道最多的方法，可以同時(shí)進(jìn)行地西泮及其代謝物的定性定量分析，定量下限達(dá)0.5 μg/kg。但目前已有研究多集中于人類的以血漿、尿液、肌肉、頭發(fā)為對象的醫(yī)學(xué)檢測和以飼料、豬肌肉、腎臟及肝臟為對象的獸藥檢測，對于水產(chǎn)品體內(nèi)這些獸藥殘留的檢測則鮮見報(bào)道。為此，筆者采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定水產(chǎn)品中地西泮及其代謝物的殘留，并提出了以含1%氨水的乙酸乙酯提取，經(jīng)正己烷去脂、HLB固相萃取柱凈化，同位素內(nèi)標(biāo)法定量的檢測方法，現(xiàn)將試驗(yàn)方法與結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（TSQ QUANTUMN ACESSES，賽默飛世爾科技有限公司）；離心機(jī)（TDL-60B，上海九亭離心機(jī)廠）；均質(zhì)機(jī)（FM200，上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52 A，上海亞榮生化儀器廠）；固相萃取裝置（VISIPREP DL，SUPELCO公司）；Oasis HLB 6 mL，200 mg固相萃取小柱（Waters 公司），使用前分別用5 mL 甲醇活化、5 mL水平衡，保持柱體濕潤。

1.1.2 主要藥劑 地西泮、去甲地西泮、奧沙西泮、替馬西泮、D5-地西泮、D5-去甲地西泮、D5-奧沙西泮、D5-替馬西泮；上述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均為1 mg/mL的甲醇溶液，同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為100 μg/mL的甲醇溶液。乙腈、甲醇（液相色譜純，Sigma公司）；正己烷、NaCl（分析純，上海國藥公司）；甲酸、氨水（液相色譜純，Sigma 公司），試驗(yàn)所用水均為超純水。

1.1.3 溶液的配制 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：用甲醇分別稀釋標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液和同位素內(nèi)標(biāo)溶液至質(zhì)量濃度均為1μg/mL，-18℃保存。標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：適時(shí)吸取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用甲醇稀釋成一定質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，<4 ℃保存。標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)工作液的配制：準(zhǔn)確吸取1 mL混合內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液，用甲醇稀釋至10 mL，得100 ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作液，<4℃保存。

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1.2 樣品前處理

1.2.1 提 取 稱取均質(zhì)樣品5.0 g置于50 mL具塞離心管中，準(zhǔn)確加入200μL內(nèi)標(biāo)工作液，避光放置10 min。加入15 mL含1%氨水的乙酸乙酯，震蕩至均勻，超聲提取10 min，4 000 r/min離心10 min，將上層液移出，重復(fù)上述步驟1次。

1.2.2 凈 化 合并兩次移出的上層液至100 mL雞心瓶中，減壓蒸除乙酸乙酯。向雞心瓶中加入3 mL預(yù)先用正己烷飽和過的乙腈，再加入6 mL正己烷，渦旋震蕩至瓶內(nèi)壁殘?jiān)咳芙庀聛恚D(zhuǎn)移雞心瓶中所有液體至20 mL具塞離心管中，2 000 r/min離心5 min，棄去正己烷層。向剩余下層液體中加入9 mL水，混勻，加入已活化平衡好的HLB固相萃取柱中，待樣液全部流出后，用5 mL水淋洗柱，真空泵抽干，10 mL乙酸乙酯洗脫。洗脫液經(jīng)減壓蒸干，用1 mL定容液（甲醇∶水=50∶50，V/V）溶解殘?jiān)ㄈ荩^0.45 μm水相濾膜后，上機(jī)測定。

1.3 高效液相色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱為CAPCELL PAK MGⅡC18（100 mm×2.1 mm id，3.5μm），柱溫20 ℃。流動(dòng)相有A-0.1%甲酸水溶液，B-甲醇。梯度設(shè)定：0～2.00 min，95%A；2.1～10.0 min，5%A；10.10～15.00 min，95%A；流速為0.2 mL/min。自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣10 μL。

質(zhì)譜條件：ESI（+）；選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）；噴霧電壓為4 500 V；離子傳輸毛細(xì)管溫度為350 ℃；源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)解離電壓為16 V；碰撞氣壓力為1.5 mTorr；鞘氣流速為11.0 L/h；輔助氣流速為6.0 L/h（表1）。

2 測定方法的選擇與探討

2.1 樣品前處理方法的選擇

鑒于地西泮及其代謝物的性質(zhì)，經(jīng)試驗(yàn)確證在提取劑中加入1%（體積分?jǐn)?shù)）氨水形成的弱堿性環(huán)境下提取，方法靈敏度較高。當(dāng)采用乙酸乙酯作為提取劑對水產(chǎn)品肌肉進(jìn)行加標(biāo)提取試驗(yàn)時(shí)，肌肉中大量脂肪亦被同時(shí)提取出。如果不除去，上機(jī)測定時(shí)會(huì)對色譜柱造成嚴(yán)重污染。利用被正己烷飽和的乙腈溶解殘?jiān)ㄟ^液–液分配去除脂肪，待測藥物損失較少。

為得到最優(yōu)的凈化效果，結(jié)合待測藥物的結(jié)構(gòu)特征，試驗(yàn)研究了Oasis HLB和Oasis MCX兩種不同固相萃取小柱的凈化效果。將待測藥物直接溶解在3 mL乙腈和9 mL水的混合液中，上樣，10 mL乙酸乙酯洗脫，蒸干定容，上機(jī)測定回收率。

HLB的回收率顯著高于MCX小柱，10 mL乙酸乙酯能充分洗脫待測藥物，且共洗脫雜質(zhì)較少。用甲醇或乙腈作定容液時(shí)，會(huì)引入儀器中大量雜質(zhì)，經(jīng)試驗(yàn)確證，采用甲醇∶水=50∶50（V/V）定容。

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2.2 儀器條件的優(yōu)化

用于地西泮及其代謝物分析的色譜柱多采用反相色譜柱，如C8、C18柱。試驗(yàn)選擇裝填了高純度硅膠基質(zhì)填料并經(jīng)端基封閉處理的CAPCELL PAK MGⅡC18色譜柱，峰形對稱性好。試驗(yàn)考察了乙腈–水和甲醇–水體系為流動(dòng)相對目標(biāo)化合物的分離效果，結(jié)果表明：這兩種體系為流動(dòng)相時(shí)，目標(biāo)化合物的質(zhì)譜信號響應(yīng)存在差別，甲醇–水體系靈敏度高且噪音小；且安全和經(jīng)濟(jì)性較乙腈–水好，綜合考慮選擇甲醇–水體系為流動(dòng)相。

ESI（+）模式下，常采用加入揮發(fā)性的酸，降低流動(dòng)相的pH，有助于待測藥物的離子化。在ESI中，流速大意味著同時(shí)進(jìn)入離子源的化合物也增多。需要同時(shí)離子化的化合物增多，加劇了待測成分與基質(zhì)成分在電離過程的競爭，從而使待測成分的響應(yīng)降低。此外，在低流速下可產(chǎn)生較細(xì)的霧滴，而使霧滴的總表面積增加，待測成分與基質(zhì)成分在表面積的競爭減少，從而有利于產(chǎn)生氣相離子，提高待測成分的信號強(qiáng)度。該試驗(yàn)中選擇流速為0.2 mL/min，既避免了待測成分因出峰過快而易受雜質(zhì)峰的干擾，同時(shí)又做到最大程度縮短分析時(shí)間，滿足了實(shí)際應(yīng)用中復(fù)雜水產(chǎn)品基質(zhì)樣品的測定。

3 方法適用性及可靠性驗(yàn)證

3.1 內(nèi)標(biāo)法定量

幾種鎮(zhèn)靜劑的極性略有差別，本試驗(yàn)中對這幾種鎮(zhèn)靜劑同時(shí)做定量分析，采用同位素氘代物作內(nèi)標(biāo)。試驗(yàn)中，待測成分與同位素內(nèi)標(biāo)的提取和色譜、質(zhì)譜行為、保留時(shí)間一致，極大地補(bǔ)償了基質(zhì)效應(yīng)的影響。

3.2 定量下限、線性范圍、回收率和精密度

經(jīng)試驗(yàn)測得在加標(biāo)量為1 μg/kg時(shí)信噪比大于10，因此將1 μg/kg定為待分析藥物的定量下限。將待測藥物配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行分析，以待測藥物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)，待測藥物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作線性回歸分析，地西泮及其代謝物在濃度為5～250 ng/mL的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999 0。回歸方程為：地西泮Y=0.068 322 8X+0.079 525 5；去甲地西泮Y=0.087 893 3X-0.642 673；奧沙西泮Y=0.071 948 2 X-0.358 441；替馬西泮Y=0.027 986 7 X+0.021 554 7。

分別以陰性的草魚、對蝦、大黃魚為測試對象，進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)，考察方法的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性。試驗(yàn)在5 g樣品中分別添加5、50、250 ng 的待測藥物，添加量相當(dāng)于1、10、50 μg/kg，每個(gè)加標(biāo)水平做6個(gè)平行試驗(yàn)，待測藥物的加標(biāo)回收率、精密度試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

由表2可知，受測試3種水產(chǎn)品，該試驗(yàn)方法的回收率和精密度均符合SN/T 0005-1996《出口商品中農(nóng)藥、獸藥殘留量及生物毒素檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)編寫的基本規(guī)定》對回收率和精密度的要求。

3.3 實(shí)際樣品分析

從上海農(nóng)貿(mào)市場購買草魚、南美白對蝦和大黃魚3種水產(chǎn)品，按該試驗(yàn)所建立的方法進(jìn)行處理和測定，測定結(jié)果為3種水產(chǎn)品中均未檢測出這幾種鎮(zhèn)靜劑殘留。

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