腦出血大鼠腦內NGF和BDNF蛋白表達變化的研究

石秋艷 何俊芳 孫惠芳 孫 鵬 劉 斌 張國志 王長友 燕 霞

1 華北煤炭醫學院附屬醫院（063000）

2 唐山市鐵路中心醫院（063000）

3 河北工程大學附屬醫院（056002）

神經營養因子是一組由多細胞分泌的對神經組織起特殊營養作用的蛋白質和多肽分子。它們不僅能夠促進發育中神經元的成熟與分化，而且還能夠阻止損傷后神經元的死亡，促進其再生。目前關于腦出血后神經營養因子的表達及分布規律的文獻報道較少，本實驗旨在研究神經生長因子（nerve growth factor，NGF）和腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）在大鼠腦出血后變化規律及其特點，探討神經營養因子在腦出血后的保護機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

健康的雄性SD大鼠（北京維通利華實驗動物技術有限公司）；NGF、BDNF多克隆抗體，二抗試劑盒及DAB顯色劑（武漢博士德公司產品）；立體定位儀。

1.2 實驗動物的分組

實驗SD大鼠，體質量200～300g，隨機分成正常組、假手術組和腦出血組，正常組6只，其余各組隨機按時間動態分為術后3、6、12、24、72h、7d，每個時間點各6只。

1.3 模型的制作

參照Deinsberer等報道的方法[1]，大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉（0.035mL/kg），固定于立體定位儀上，于前囟前0.2mm中線向左側旁3mm處鉆一直徑約為1mm的小孔，斷尾取血，用微量注射器沿鉆孔方向將50mL的不凝血緩慢注入左側尾狀核，留針10min，之后緩慢退針，縫合頭皮。假手術組除不注射自體血外，余操作同實驗組。實驗過程中出現大鼠死亡及時補充。

1.4 模型成功的判斷標準

表1 不同時間點各組大鼠腦內NGF陽性細胞數比較

表2 不同時間點各組大鼠腦內BDNF表達

腦出血組術后可見明顯的肢體癱瘓，沿針道冠狀切面切開腦組織可見血腫形成，正常組和假手術組肢體活動自如。

1.5 標本制取與組織學檢查

各組大鼠在不同時間點給予水合氯醛腹腔麻醉（0.035mL/kg），開胸，將37℃ 0.9%氯化鈉水溶液緩慢推入動物的體循環，持續3～5min（200mL）至右心房流出的液體基本無色，將灌流液換4%多聚甲醛磷酸緩沖液，取大腦組織固定于4%多聚甲醛24h，石蠟包埋組織學觀察。

1.6 免疫組織化學染色法

嚴格按照說明書要求，①常規脫蠟至水。②3%H2O2室溫20min滅活內源性酶。③高壓修復抗原。④滴加封閉液20min。⑤加NGF、BDNF多克隆抗體4℃過夜。⑥滴加生物素化山羊抗兔二抗IgG 20min。⑦SABC 37℃反應30min，⑧DAB顯色⑨蘇木素復染，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察結果。

1.7 記數方法及陽性結果判定

隨機選取大鼠腦內陽性細胞區域5個不同視野，記錄陽性細胞數。

1.8 數據處理

應用SPSS16.0軟件行單因素方差分析和t檢驗，P＜0.05為統計學檢驗標準。

2 結 果

2.1 NGF在腦出血大鼠腦內表達的變化規律

在正常組和假手術組中可見少量的NGF陽性細胞，主要位于大腦皮質及海馬部位，并在各時間點無明顯的變化。在腦出血組中，6h時NGF在血腫周圍已經出現表達增強，于24h達高峰，在以后的時間點逐漸下降。從陽性細胞的形態來看，大部分為神經元細胞，胞體較大，形態較規則，免疫陽性顆粒位于胞體和突起，呈均勻的棕黃色顆粒。小部分是小膠質細胞，呈圓形或橢圓形，形態不規則，陽性顆粒位于細胞胞質。正常組陽性細胞數為（4.0±1.26），假手術組及腦出血組陽性細胞數，見表1。

2.2 BDNF在腦出血大鼠腦內表達的變化規律

免疫陽性顆粒主要位于神經元細胞核和和細胞質，以胞漿邊緣顯色較深，正常組和假手術組可在大腦皮質及海馬部位發現BDNF少量表達。在腦出血組12h時，BDNF在血腫周圍表達增加，陽性細胞密度增加（P＜0.05），于24h達高峰，7d仍有一定程度的高表達，與正常組和假手術組比較差異具有顯著性（P＜0.05）。正常組陽性細胞數為（3.17±1.16），見表2。

3 討 論

3.1 NGF變化特點分析

NGF廣泛分布于中樞神經系統中，對神經系統有重要的神經營養和促神經突觸生長的生物學效應。大量研究表明，NGF對ICH血腫周圍損傷神經元具有保護和修復作用[2]。其神經保護可能機制為：①NGF 通過增加過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等自由基清除劑的活性，減輕腦出血后引起的神經元的損傷[3]。②抗細胞凋亡[4]。③維持細胞內Ca2+的穩態[5]。我們的實驗動態觀察了NGF在腦出血大鼠腦組織中表達的變化，在正常組和假手術中，發現少量的NGF陽性細胞，腦出血組6h，在血腫周圍開始出現大量深棕色的陽性細胞，24h達高峰，48h已經開始下降，與正常組和假手術比較差異有顯著性，說明在腦出血后，腦損傷后可誘導NGF一過性表達增高，從而發揮神經保護作用，但是時間短暫，含量低微。

3.2 BDNF變化特點分析

BDNF是成年大鼠腦內分布最廣泛的神經營養因子，不僅調節神經元的生長、分化及軸突的功能，而且也是神經元維持生存和執行正常功能所必需的。在中樞神經系統損傷后，BDNF可為受損神經元提供營養而促進其存活與修復[6]。許多實驗證實，BDNF通過激活其受體TrkB，阻斷胞內損傷因子對蛋白激酶C的失活，以防止神經元發生變性、死亡[7]。我們的實驗結果顯示：12h時，BDNF在血腫周圍表達增加（P＜0.05），于24h達高峰，與假手術組及正常組差異有統計學意義，其可能的機制為腦出血后腦損傷激發自我保護機制，誘導BDNF蛋白表達及分泌增加，保護受損神經元。傳統的觀念認為，BDNF是在靶器官合成，通過逆轉運到神經元，發揮營養和維持存活作用的一種蛋白。Schutte等[8]研究發現，BDNF以出胞的形式分泌到細胞外基質，對臨近的神經細胞發揮營養作用。我們的實驗發現，在正常組和假手術組中，BDMF的陽性細胞主要分布于大腦皮質及海馬部位，腦出血后，皮質及海馬部位均表達增高，陽性細胞數數量增加，我們推測可能BDNF蛋白在皮質、海馬及血腫周圍的神經元或膠質細胞中合成，逆轉運到達血腫周圍，通過自分泌或旁分泌的方式發揮營養作用，這與以往的實驗結論不同，但確切的機制尚不清楚。

另外實驗發現，NGF和BDNF在空間分布上具有重疊性，時間變化上具有一定的相似性，是否兩者在發揮神經保護作用中具有交叉或協同作用，有待于進一步研究。

綜上所述，腦出血后腦損傷可激發內源性神經保護機制，引起NGF及BDNF蛋白表達增加，但其作用有限，時間短暫。

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