超聲強化提取仙草黃酮及其抗氧化活性研究

朱 良 尹懷霞

仙草（Mesona Blume）又名涼粉草、仙人草，為唇形科仙草屬一年生草本植物，作為一種重要的藥食兩用的植物資源，在我國和東南亞地區已經有悠久的歷史。仙草分布于我國的廣東、廣西、福建、江西、海南、浙江、臺灣和云南等地(諶國蓮，2000)。《中藥大辭典》記載：仙草性味澀、甘、寒，具清暑解渴、涼血之功效，可治中暑、高血壓、肌肉及關節疼痛。仙草還可作為飼料添加劑使用，即使是水提取后的渣，也可以用作飼料(劉曉庚,2004)。劉富來等(2009)選用仙草全草煎液，應用于鴨群，對禽大腸桿菌和沙門氏菌病有較好抑制效果。

黃酮化合物是在植物體中廣泛存在的一類天然產物，具有抗心腦血管疾病、抗衰老、抗氧化、消炎鎮痛、免疫調節、降血糖等多種重要的生理功能(張培成，2009)。仙草中黃酮類化合物的含量超過5.0%(何明祥,2008)，近年發現仙草有很強的抗氧化作用，并推測其抗氧化功能與其所含的黃酮、多酚類有關(楊敏,2006)。我國仙草資源豐富，價格較低，積極進行仙草黃酮提取及其制品的研究，可促進仙草這一特種經濟作物的產業化發展，提高養殖區的社會效益和經濟效益。

傳統的黃酮類物質提取方法有堿性水提取法、醇提取法和其它有機溶劑提取法等 (李巧玲,2003)。但是，這些方法溫度高，用時長，黃酮類物質因為離子化、氧化和水解而損失(Li Hui,2005)。超聲輔助提取是一種操作簡單，效費比較高的技術(Wang Jing,2007)，超聲空化可對細胞壁產生機械的修剪力，使細胞壁破裂，同時，超聲可促進溶劑和活性成分的雙向轉移(Romdhane M,2002)。超聲波用于輔助從植物中提取活性物質可減少溶劑用量和提取的時間，降低提取溫度，有利于提取熱敏感物質和不穩定的物質。

本文采用超聲波強化提取仙草中的黃酮類化合物。通過正交試驗確定了超聲波輔助提取仙草中黃酮類物質的最佳工藝條件，同時對提取液進行了清除OH·和DPPH·作用的研究，以期為仙草的有效開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.2 藥品與儀器

蘆丁標準品購自中國藥品生物制品所；1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH·）購自Sigma公司；抗壞血酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇、硫酸亞鐵、水楊酸等試劑均為國產分析純；試驗用水為二次去離子水。

VIS-7220N可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）；JA2003電子天平（上海精密科學儀器廠）；HH-S數顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇醫療儀器）；XA-1型固體樣品粉碎機（江蘇省金壇市環宇科學儀器廠）；LD5-2A型離心機（北京醫用離心機廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線的制備

稱取110℃干燥至恒重的蘆丁標準品50.0 mg，加濃度70%乙醇溶解并定容至200 ml容量瓶中，搖勻，制成0.25 mg/ml的蘆丁標準品溶液；分別取該溶液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml置于容量瓶中，各加水6.0 ml，再加5%亞硝酸鈉1.0 ml，混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁1.0 ml，混勻，放置6 min，再加4%氫氧化鈉10 ml，用30%乙醇定容，搖勻，放置15 min。以試劑空白作參比，在波長510 nm處測定其吸光度；以標準樣品質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.2 超聲提取工藝條件

提取時，準確稱取一定量的仙草干粉，加入不同濃度提取溶劑，選取不同超聲提取溫度和提取時間，放入超聲波儀中進行提取（提取時加回流裝置，以防溶劑損失）。將提取液過濾、定容，測定吸光度，計算總黃酮含量。以每克干草所提取的總黃酮（以蘆丁計）的毫克數表示總黃酮提取率。

根據新修訂的協議，《所有權共有協議》有關項目不利事件的規定將被修訂為：未來估計造價的進一步增加將不再觸發對是否繼續建設的表決，喬治亞電力能夠隨時自行決定是否取消該項目。

1.3.3 超聲波提取仙草總黃酮正交優化試驗(見表1)

表1 乙醇超聲波提取法正交試驗因素水平

為了確定在多因素條件下超聲波提取仙草黃酮類化合物的最佳工藝，本文選擇合適的參數范圍，對提取溫度、時間、乙醇濃度、超聲波功率4個因素安排及進行L9(34)正交試驗，以黃酮類化合物的提取率為評價指標，優化最佳提取工藝。

1.4 仙草黃酮的抗氧化作用

1.4.1 仙草黃酮對OH·的清除作用

在試管中依次加入6 mmol/l的FeSO4溶液2 ml，不同濃度的黃酮提取物溶液2 ml，6 mmol/l的H2O2溶液2 ml，搖勻，靜置10 min，再加入 6 mmol/l的水楊酸溶液2 ml，搖勻，靜置30 min后以5000 r/min轉速離心5 min，于510 nm處測其吸光值。清除率計算公式為：

清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

式中：A0——用水代替抗氧化劑時測得空白對照吸光度；

Ai——黃酮提取物溶液的吸光值；

Aj——無水楊酸時黃酮提取物溶液的吸光值。每個樣品測3次，取平均值。以抗壞血酸（VC）作陽性對照。

1.4.2 仙草黃酮對1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH·）的清除作用

取一定濃度待測樣品的乙醇溶液2 ml，加入2 ml濃度為0.1 mmol/l的DPPH·乙醇溶液，立即混勻，避光反應30 min，以等體積的去離子水代替樣品溶液作對照組，等體積的乙醇代替DPPH·作空白組。于510 nm處測定吸光度直到讀數穩定。清除率計算公式為：

清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

式中：Aj——空白組吸光值；

Ai——黃酮提取物溶液的吸光值；

A0——對照組吸光值。每個樣品測3次，取平均值。以抗壞血酸（VC）作陽性對照。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線

計算得吸光度(A)對質量濃度(C)的線性回歸方程為：A=11.886C-0.0079，R2=0.9993，在 10～60 mg/l范圍內呈良好的線性關系。

2.2 正交試驗結果與分析（見表2）

由表2可以看出，影響仙草中總黃酮提取率的因素主次順序為：超聲波功率＞提取時間＞乙醇濃度＞提取溫度。由表2可知，超聲波提取仙草黃酮類化合物的最佳組合為A2B2C3D2，即提取溫度60℃，提取時間30 min，乙醇濃度80%，超聲波功率200 W。

在最佳工藝條件A2B2C3D2進行3次平行試驗，結果仙草總黃酮的得率為2.05%，高于正交試驗的結果，表明這種工藝條件比較合理。

表2 正交試驗結果

對試驗結果進行方差分析、F檢驗，結果如表3所示。

表3 正交設計方差分析結果

由表3方差分析看出，在超聲波提取仙草黃酮類化合物正交試驗中所選擇的因素和水平范圍內，超聲波功率因素都達到顯著水平（P＜0.05），而其它各因素影響不顯著。

2.3 仙草黃酮提取物對OH·的清除作用

根據1.4.1的方法，研究仙草黃酮提取物清除羥自由基的能力，以抗壞血酸作陽性對照，結果見圖1。

圖1 仙草黃酮提取物對OH·的清除效果

由圖1可知，在仙草黃酮提取物及抗壞血酸（VC）兩者對OH·均有較強的清除能力，且對OH·的清除能力隨其質量濃度的增加而增大，這說明提取物含供氫體，具有提供氫質子的能力，可使具有高度氧化性的自由基還原，從而能終止自由基連鎖反應，起到清除或抑制自由基的目的。當濃度小于0.8 g/l時，仙草黃酮提取物清除率不如抗壞血酸（VC）；當濃度達到0.8 g/l后，再增加濃度，提取物清除率高于抗壞血酸（VC），但兩者的提高速率變緩。

2.4 仙草黃酮提取物對DPPH·的清除作用

根據1.4.2的方法，測定仙草黃酮提取物清除DPPH·自由基的能力，以抗壞血酸（VC）作陽性對照，結果見圖2。

圖2 仙草黃酮提取物對DPPH·的清除效果

由圖2可知，仙草黃酮對DPPH·具有較強的清除作用，在所選濃度范圍內，兩者對DPPH·的清除能力隨著濃度的增大而增強。當濃度小于0.8 g/l時，提取物清除率不如抗壞血酸（VC）；當濃度達到0.8 g/l后，再增加濃度，提取物清除率高于抗壞血酸（VC），但兩者的提高速率變緩。

3 結論

通過正交試驗得出，超聲波輔助提取仙草中黃酮類化合物的最佳工藝條件為：提取溫度60℃，提取時間30 min，乙醇濃度80%，超聲波功率200 W。在此條件下粗黃酮得率達到2.05%。仙草黃酮對羥自由基（OH·）和1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH·）均有較好的清除效果，是一種有效的外源性抗氧化劑，可通過直接或間接的途徑清除氧自由基，阻斷脂質過氧化的進程，其清除機理有待進一步研究。

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