t10,c12-CLA對(duì)豬皮下脂肪和背最長(zhǎng)肌組織脂類代謝的影響

杜瑞平 高 民 盧德勛

共軛亞油酸（CLA）是亞油酸（LA）衍生的共軛雙烯的多種位置與空間異構(gòu)體的總稱。理論上其主要位置異構(gòu)有四種即 8，10-、9，11-、10，12-和 11，13-，而每種異構(gòu)體又有四種幾何異構(gòu)體，因此共軛亞油酸的種類十分豐富，但無(wú)論是天然的還是人工合成的CLA，只有c-9，t-11和t-10，c-12是其最主要的生物活性異構(gòu)體。近年來(lái)，共軛亞油酸(CLA)的生物學(xué)功能備受矚目。作為一種新型功能性油脂，共軛亞油酸具有抗癌、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗糖尿病、降低胴體脂肪含量、調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)生長(zhǎng)、增加瘦肉率、改善肉品質(zhì)及影響骨骼形成等諸多生理功能。c9，t11-CLA在提高動(dòng)物機(jī)體的免疫力、抗癌和提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能方面作用較大,而t10,c12-CLA在改變動(dòng)物機(jī)體的脂肪代謝方式以及降低脂肪在動(dòng)物體內(nèi)的沉積方面起主要作用[1]。

動(dòng)物體脂的沉積是脂肪合成代謝與分解代謝的一種動(dòng)態(tài)平衡，其沉積能力包括脂肪的合成、分解和轉(zhuǎn)運(yùn)三個(gè)方面。酶和激素在這些代謝過程中起到了至關(guān)重要的作用[1]。Lin 等（2001）發(fā)現(xiàn)，t10，c12-CLA顯著降低了3T3-L1前脂肪細(xì)胞中LPL、FAS和AP2基因 mRNA 的水平[2]。Brandebourg 和 Hu（2005）也報(bào)道，CLA通過下調(diào)脂肪分化過程中關(guān)鍵基因的表達(dá)抑制豬皮下脂肪前體細(xì)胞的分化，進(jìn)而抑制脂類沉積[3]。那么t10，c12-CLA對(duì)豬皮下脂肪和背最長(zhǎng)肌兩個(gè)部位前脂肪細(xì)胞增殖與分化及脂類代謝與沉積的影響是通過怎樣的調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行調(diào)控，本試驗(yàn)即在mRNA水平上研究t10，c12-CLA對(duì)脂類代謝關(guān)鍵酶中的脂肪酸合成酶（FAS）、蘋果酸酶（ME）、激素敏感酯酶（HSL）、脂蛋白酯酶（LPL）及脂類代謝調(diào)控激素中的胰島素和生長(zhǎng)激素受體（INSR、GHR）的影響，旨在進(jìn)一步探討CLA對(duì)豬皮下脂肪和背最長(zhǎng)肌組織脂類代謝的影響并初步揭示其機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院豬場(chǎng)30日齡豬。

1.2 試驗(yàn)試劑

t10，c12-CLA購(gòu)買自Matreya公司；胰島素、地塞米松、甲基異丁基黃嘌呤、青霉素和鏈霉素購(gòu)買自Sigma公司；DMEM/F12干粉培養(yǎng)基、胎牛血清、牛血清白蛋白和膠原酶Ⅱ購(gòu)買于Gibico公司；RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和普通PCR反應(yīng)所用試劑及定量PCR試劑盒（SYBR Green PCR Kit）購(gòu)自上海生物工程技術(shù)有限公司；DNA Marker（DL1000）購(gòu)自 TAKARA 公司，TG測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京五洲元業(yè)試劑公司，其余化學(xué)試劑購(gòu)自南京建成生物試劑公司。

1.3 主要溶液配制

DMEM/F12培養(yǎng)液：10.0 g/l DMEM/F12培養(yǎng)基，三蒸水，10%胎牛血清，100 IU/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素，1.2 g/l NaHCO3，過濾（0.22 μm 濾膜）除菌，按每次實(shí)驗(yàn)需要量分裝，4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

組織消化液：Ⅱ型膠原酶配成1 mg/ml HBSS液，過濾除菌，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

100 μmol/l CLA 液:先用 100 μl無(wú)水乙醇溶解25 mg CLA，加入8.93 ml培養(yǎng)液配成0.01 mol/l的母液，濾菌，-20℃保存，使用時(shí)用培養(yǎng)液稀釋即可。

分化儲(chǔ)備液：分別稱取胰島素5.00 mg、地塞米松0.2 mg、甲基異丁基黃嘌呤55.63 mg溶于500 μl無(wú)水乙醇中，待完全溶解后加三蒸水至50 ml，濾菌，-20℃保存。

1.4 組織塊培養(yǎng)[4]

（1）無(wú)菌切取仔豬肩胛部皮下脂肪約5 g、背最長(zhǎng)肌約8 g，75%酒精中浸泡3～5 s，然后用D-Hanks液清洗3次，置于消毒的PBS液中；（2）在培養(yǎng)液或者平衡鹽溶液中分離去除組織中可見的纖維及血管,反復(fù)剪切至1 mm3大小為止（呈糊狀）。然后用吸管吸取HBSS液把附著在剪刀上的組織小塊沖下，并補(bǔ)加3～5 ml HBSS液后，去上清，余下的組織塊即可用于培養(yǎng)；(3)用眼科探針將組織小塊均勻擺布于60 cm的培養(yǎng)皿，每小塊間距約0.5 cm，置5%CO2、37℃培養(yǎng)箱1～2 h左右，再向底部輕輕注入5 ml完全培養(yǎng)液，于CO2培養(yǎng)箱(37℃,5%CO2)中靜置培養(yǎng)，開始2 d盡量不去搬動(dòng)，以利貼壁和生長(zhǎng)，培養(yǎng)第3 d換液，此后每2 d換液一次。細(xì)胞匯合后用基礎(chǔ)培養(yǎng)液漂洗后（一定不要剩余血清），然后改用無(wú)血清分化培養(yǎng)液培養(yǎng)至第10 d。

1.5 TG含量測(cè)定

試驗(yàn)處理第9 d收集各組細(xì)胞，超聲波處理，按TG試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TG含量，結(jié)果以μmol/ml表示。

1.6 熒光定量PCR

1.6.1 引物設(shè)計(jì)與合成

登陸NCBI網(wǎng)站查詢相關(guān)基因序列，使用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)PCR特異引物，委托上海生物工程公司合成。將凍干粉狀態(tài)的引物離心后，用滅菌超純水配制成 100 μmol/l貯備液和 20 μmol/l工作液，-20 ℃保存。

1.6.2 熒光定量PCR

定量PCR反應(yīng)體系見表2。優(yōu)化反應(yīng)程序如下：（1）95 ℃預(yù)變性 15 min；（2）95 ℃變性 30 s；（3）53～60 ℃退火30 s；（4）72 ℃延伸30 s，循環(huán)40 次；（5）72 ℃延伸1 min；（6）70～95℃生成融解曲線。反應(yīng)結(jié)束后，樣品保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.7 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

共設(shè)2個(gè)處理，處理1為陰性對(duì)照（添加0.1mmol/l BSA），處理 2 添加 100 μmol/l的 t10，c12-CLA，每個(gè)處理設(shè)6個(gè)平行，培養(yǎng)開始即加入BSA與t10，c12-CLA進(jìn)行處理至第10 d。試驗(yàn)結(jié)束后收集細(xì)胞保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物設(shè)計(jì)參數(shù)

表2 熒光定量PCR反應(yīng)體系

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 11.5軟件中單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。P＜0.05時(shí)確定為差異顯著，P＜0.01時(shí)確定為差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 t10,c12-CLA對(duì)豬皮下脂肪和背最長(zhǎng)肌內(nèi)脂類代謝關(guān)鍵酶的影響（見圖1）

圖1 脂肪代謝酶FAS、ME、LPL及HSL的相對(duì)基因表達(dá)水平

圖1為熒光定量PCR測(cè)定脂肪代謝關(guān)鍵酶類FAS、ME、LPL及HSL的分析結(jié)果。脂質(zhì)的積累是脂肪合成與分解代謝的動(dòng)態(tài)平衡結(jié)果，在這一過程中，生脂酶和解脂酶發(fā)揮著重要作用，F(xiàn)AS與ME是脂肪酸生物合成甘油三酯反應(yīng)的主要限速酶之一，LPL和HSL則是參與脂肪分解過程的關(guān)鍵酶類，它們是脂肪代謝和沉積的系列酶促反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素，它們的表達(dá)水平和活性高低預(yù)示著TG合成的變化。本試驗(yàn)結(jié)果表明，100 μmol/l t10,c12-CLA顯著抑制了豬皮下脂肪FAS基因表達(dá)及背最長(zhǎng)肌HSL和LPL基因表達(dá)，并顯著提高了豬皮下脂肪HSL基因表達(dá)（P＜0.05），兩個(gè)部位其它酶基因則無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。我們由此可以發(fā)現(xiàn)，t10,c12-CLA處理后，豬皮下脂肪的脂肪合成相關(guān)酶（FAS）基因表達(dá)顯著下降的同時(shí)脂肪分解酶（HSL）基因表達(dá)顯著提高，而背最長(zhǎng)肌的脂肪分解酶 (HSL、LPL)基因表達(dá)則顯著下降，這一變化規(guī)律預(yù)示t10,c12-CLA處理后，就酶的作用而言，豬皮下脂肪的脂肪合成代謝弱于分解代謝，而肌內(nèi)脂肪的脂肪合成代謝則強(qiáng)于分解代謝。

2.2 t10,c12-CLA對(duì)皮下脂肪和背最長(zhǎng)肌組織脂類代謝關(guān)鍵調(diào)控激素的影響

機(jī)體對(duì)代謝途徑反應(yīng)速度的調(diào)節(jié)控制能力稱為物質(zhì)代謝調(diào)節(jié)(Metabolic regulation)，生物的進(jìn)化程度越高，代謝調(diào)節(jié)越復(fù)雜，越精細(xì)。物質(zhì)代謝調(diào)節(jié)包括細(xì)胞水平、激素水平和整體水平三種調(diào)節(jié)方式[5]。上一小節(jié)關(guān)于酶基因表達(dá)即屬于細(xì)胞水平調(diào)節(jié)，這一小節(jié)對(duì)激素水平進(jìn)行了研究。與脂肪代謝有關(guān)的激素，包括很多種，生長(zhǎng)激素和胰島素是其中重要的兩種，生長(zhǎng)激素（GH）有促進(jìn)脂肪分解、抑制脂肪合成的作用；而胰島素(INS)則有促進(jìn)生脂、抑制解脂的作用。GH和INS發(fā)揮生理作用的第一步是與靶細(xì)胞膜表面的受體(GHR，INSR)結(jié)合，由受體介導(dǎo)將信號(hào)傳入胞內(nèi)從而發(fā)揮其生物學(xué)功能[6-7]，所以說(shuō)受體的表達(dá)和活性最終反映了相應(yīng)激素的調(diào)節(jié)能力，因此本研究對(duì)兩種激素受體GHR和INSR進(jìn)行了mRNA水平的測(cè)定。圖2為熒光定量PCR測(cè)定GHR和INSR的分析結(jié)果。結(jié)果表明，100 μmol/l t10,c12-CLA顯著抑制了豬皮下脂肪INSR基因表達(dá)，并提高了豬背最長(zhǎng)肌INSR基因表達(dá)水平（P＜0.05），而兩個(gè)部位GHR基因表達(dá)的處理組與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。此結(jié)果也說(shuō)明100 μmol/l t10,c12-CLA通過調(diào)節(jié)豬皮下脂肪和背最長(zhǎng)肌組織內(nèi)INSR水平進(jìn)而影響兩個(gè)部位的脂肪代謝。

圖2 GHR和INSR的相對(duì)基因表達(dá)水平

2.3 t10,c12-CLA對(duì)豬皮下脂肪和背最長(zhǎng)肌組織TG合成的影響（見圖3）

圖3 t10,c12-CLA對(duì)TG含量的影響

前體脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞后，伴隨分化所發(fā)生的分子事件的最終結(jié)果都表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)TG含量的變化，為定量檢測(cè)t10,c12-CLA對(duì)皮下脂肪和背最長(zhǎng)肌組織脂肪沉積的影響，本試驗(yàn)采用TG試劑盒測(cè)定 TG含量。 結(jié)果表明（見圖 3），100 μmol/l t10,c12-CLA顯著降低了豬皮下脂肪內(nèi)TG含量，而提高了豬背最長(zhǎng)肌的的TG含量（P＜0.05）。充分說(shuō)明t10,c12-CLA抑制了豬皮下脂肪沉積的同時(shí)提高了肌內(nèi)脂肪含量。TG的變化規(guī)律也與前面脂肪代謝酶與激素所表明的兩個(gè)部位脂肪合成與分解代謝規(guī)律相一致。

2.4 總體討論

關(guān)于CLA對(duì)脂肪組織脂質(zhì)代謝和沉積的影響，Evans等（2002）的研究結(jié)果表明，t10，c12-CLA 可減少細(xì)胞中甘油三酯含量[8]。Lin 等（2001）發(fā)現(xiàn)，t10，c12-CLA顯著降低了3T3-L1前脂肪細(xì)胞中LPL、FAS和AP2基因mRNA的水平[2]。有關(guān)CLA抑制脂肪細(xì)胞分化，減少甘油三酯沉積的機(jī)理，在鼠上及3T3-L1前脂肪細(xì)胞系上的研究表明t10，c12-CLA對(duì)脂肪細(xì)胞分化以及甘油三酯沉積的抑制主要是由于該單體對(duì)前脂肪細(xì)胞增殖的抑制以及提高了細(xì)胞中脂類的分解[9-10]，而t10，c12-CLA對(duì)人脂肪細(xì)胞分化和甘油三酯沉積的抑制則主要是通過抑制前脂肪細(xì)胞分化過程來(lái)實(shí)現(xiàn)[11-12]。在豬脂肪體外培養(yǎng)試驗(yàn)中，有關(guān)CLA調(diào)控作用的報(bào)道也不一致[3，13-15]，但正效應(yīng)報(bào)道表明，一方面，CLA可以通過抑制豬前脂肪細(xì)胞的增殖、分化以及脂類合成的關(guān)鍵酶基因的表達(dá)來(lái)減少脂肪的沉積；另一方面，CLA通過與脂肪酸氧化分解相關(guān)的酶，如脂酰輔酶A合成酶、脂酰輔酶A脫氫酶等結(jié)合，增強(qiáng)脂肪酸的氧化，從而減少甘油三酯合成。

結(jié)合前面的研究結(jié)果，我們可以這樣認(rèn)為：t10，c12-CLA顯著抑制和促進(jìn)豬皮下和背最長(zhǎng)肌前脂肪細(xì)胞分化和脂類沉積中的關(guān)鍵基因如FAS、INSR、LPL、HSL等的基因表達(dá)，從而抑制和促進(jìn)了前脂肪細(xì)胞的分化最終影響其甘油三酯沉積。

3 小結(jié)

本試驗(yàn)中，100 μmol/l t10,c12-CLA（10 d處理）顯著抑制了豬皮下脂肪FAS、INSR與背最長(zhǎng)肌HSL和LPL的基因表達(dá)并降低了皮下脂肪的TG含量，同時(shí)顯著促進(jìn)了豬皮下脂肪HSL和背最長(zhǎng)肌INSR的基因表達(dá)并提高了豬背最長(zhǎng)肌的TG含量（P＜0.05）；本研究結(jié)果從脂肪代謝關(guān)鍵酶類及調(diào)控激素角度揭示了t10,c12-CLA對(duì)豬皮下脂肪和背最長(zhǎng)肌組織脂肪代謝和沉積的差異性調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步證實(shí)了t10,c12-CLA抑制豬皮下脂肪沉積同時(shí)提高肌內(nèi)脂肪含量。

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