胃癌組織中p16基因甲基化水平以及mRNA表達的關系

朱新江* 張 凱 秦 偉 馮 祿

胃癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，在我國胃癌病死率為25.2/10萬（男性32.8/10萬，女性17.0/10萬），占全部惡性腫瘤死亡的23.2%（男性是女性的1.9倍），嚴重威脅人民群眾的生命健康。近幾年，表遺傳學改變的研究取得了突飛猛進的進展，成為胃癌臨床基礎研究的一個前沿陣地。p16基因是已經確認的最重要的抑癌基因之一，在胃癌細胞凋亡過程中起著重要作用[1-3]。

1 材料與方法

1.1 一般資料

表1 p16基因和GAPDH的RT- PCR引物序列及PCR條件

表2 p16基因甲基化和非甲基化引物序列及PCR條件

選擇2005年1月至2008年1月?lián)犴樖兄行尼t(yī)院普外科切除的胃癌患者50例，男44例，女6例，年齡40～74 歲，平均（58±9.76）歲。手術取下的新鮮標本立即浸入液氮中后置于-70℃冰箱保存。 Wizard DNA cleap up 純化試劑盒（美國Promega公司），亞硫酸氫鈉（美國Sigma公司），SYBR GreenI 實時定量PCR逆轉錄試劑盒（日本TaKaRa公司），TRIzol（美國Invitrogen公司），Taq酶和dNTP（日本TaKaRa公司）引物（北京三博遠志生物技術有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 RT-PCR分析胃腺癌標本中p16基因MRNA的表達

用TRIzol 試劑一步法分別提取胃癌組織總RNA（按說明書進行）。按照反轉錄試劑盒說明將其反轉錄成cDNA第一鏈。PCR反應條件：首先進行預變性，時間為4min，預變性溫度為93℃。預變性之后進行35個循環(huán)：溫度和時間分別為 92℃ 30s、51℃ 30s，71℃ 45s，最后延伸10min溫度為72℃。用瓊脂糖凝膠上電泳分離PCR產物，GB染色，利用凝膠成像分析系統(tǒng)檢測PCR產物吸光度值，將各基因與GAPDH吸光度比值作為其mRNA水平的相對值，mRNA表達水平取其平均值進行統(tǒng)計分析。

1.2.2 甲基化特異性PCR檢測p16基因啟動子區(qū)DNA甲基化

首先用酚-氯仿分別提取胃癌組織中基因組DNA，并用紫外分光光度儀進行定性、定量。亞硫酸氫鈉修飾DNA后，純化，洗滌并離心基因組DNA。利用基因組DNA進行PCR反應，條件如下：95℃12 min后，95℃變性30s，各種基因不同退火溫度退火45s，71℃延伸30s，34個循環(huán)，74℃再延伸7min，瓊脂糖凝膠電泳，EB染色。結果經Alpha Image 2000自動成像儀成像采集數(shù)據(jù)，分析電泳結果。

1.3 結果判定

基因組DNA經過MSP擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳，如果沒有出現(xiàn)甲基化條帶而出現(xiàn)非甲基化條帶，則該標本p16基因啟動子區(qū)CpG島發(fā)生非甲基化；如果沒有出現(xiàn)非甲基化條帶而出現(xiàn)甲基化條帶，則該標本p16基因啟動子區(qū)CpG島發(fā)生甲基化；甲基化條帶和非甲基化條帶同時出現(xiàn)，則該標本p16基因啟動子區(qū)CpG島發(fā)生半甲基化（屬于甲基化）。

1.4 統(tǒng)計學分析

用SPSS13.0軟件分析，mRNA表達水平定量測定計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 MSP結果

見圖1。

MS-PCR檢測胃癌中p16基因甲基化狀態(tài)，M=206bp，U=206bp。M：甲基化：U：未甲基化：Pos：陽性對照。Neg：陰性對照。DW：蒸餾水對照；Blank：標本1，2為甲基化；標本3，4為非甲基化。

2.2 RT-PCR結果

圖1 胃癌組織p16基因甲基化PCR擴增產物電泳分析圖

50例胃腺癌中甲基化組p16基因mRNA表達量為（0.12±0.05），非甲基化組mRNA表達量為（0.77±0.13），甲基化組p16基因mRNA表達量明顯低于非甲基化組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義，見表1、表2。

3 討 論

生物基因組儲存著遺傳學和表遺傳學兩種信息，遺傳學的信息決定著生物體細胞基因型；而表遺傳學是指不涉及DNA序列改變的，可以通過細胞分裂進行傳遞的信息，它參與基因表達調控，這種表觀遺傳修飾對于腫瘤的發(fā)生具有重大意義。DNA甲基化和組蛋白修飾、染色質重塑等是表觀遺傳修飾的主要方式。其中DNA 甲基化是導致腫瘤最常見的表遺傳學事件，因而研究甲基化與腫瘤的關系成為目前腫瘤分子生物學研究的熱點之一[4]。

p16基因又稱多腫瘤抑制基因（multiple tumorsuppressor，MTS）被認為是最經典的腫瘤抑制基因。國內外多項科研[5,6]證實，p16基因甲基化與多種消化系統(tǒng)腫瘤特別是胃癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的關系，他們的研究分為兩類：一類應用甲基化敏感性限制性內切酶方法或MSP等方法研究胃癌細胞株或胃癌組織p16基因啟動子區(qū)CpG島發(fā)現(xiàn)其甲基化率為30%～40%，且發(fā)生胃癌組織p16基因啟動子區(qū)CpG島甲基化的樣本多不表達p16mRNA及p16 蛋白；另外一類研究體外應用去甲基化劑5-deoxy-azacytidine對胃癌細胞處理后，可使胃癌細胞p16基因啟動子區(qū)CpG島異常甲基化而封閉的基因重新表達。上述的各項研究結果均有力的證明了p16基因CpG島甲基化可以導致p16mRNA及p16 蛋白表達缺失，去甲基化劑可恢復p16mRNA及p16 蛋白的表達證實該基因的甲基化是其失活的重要原因。

本實驗通過測定胃腺癌組織中甲基化水平及mRNA表達的關系再次證實導致p16基因沉默的主要原因為DNA甲基化，于國內外的主流研究達成共識。p16基因啟動子區(qū)CpG島異常甲基化導致p16基因沉默還可能在大腸癌，食管癌中有類似結果。胃癌在我國惡性腫瘤的病死率居于首位，主要原因在于50%的胃癌患者確診時已屬晚期，表遺傳學研究對胃癌的早期篩查及判斷癌細胞的轉移有著重要的意義，同時對于晚期胃癌目前的手術+化療的模式已無法從根本上提高晚期胃癌的五年生存率。而表遺傳學治療包括去甲基化及乙酰化治療剛剛起步，給腫瘤的治療帶來新的希望，但表遺傳學治療藥物在實體瘤應用的某些機制尚未明確，仍需進一步研究。目前沒有一種基因藥物能有效抑制腫瘤，隨著對表遺傳學改變的認識，對表遺傳學藥物的研究將為腫瘤的治療開辟新的領域。

[1] Hong SH,Kim HG,Chung WB,et al.DNA Hypermethylation of Tumor-Related Genes in Gastric Carcinoma[J] Korean Med Sci,2005,20(2):236-241.

[2] Jones PA,Laird PW. Cancer epigenetics comes of age[J] .Net Genet,1999,21(4):163-167.

[3] Robertson KD,Jones PA,Balin SB,et al. DNA methylation: pastpresent and future directions[J] . Carcinogenesis,2000,21(3):461-467.

[4] Kondo Y,Shen LL.Critical Role of Histone Methylation in Tumor SuppressorGene Silencing in Colorectal Cancer[J] .Mol Cell Biol,2003,23(1):206-215.

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[6] Louie MC,Revenko AS,Zou JX,et al. Direct control of cell cycle gene expression by proto-oncogene product ACTR, and its autoregulation underlies its transforming activity[J] . Mol Cell Biol,2006,26(10):3810-3823.