小鼠結腸癌肝轉移模型的構建

楊 揚* 李乃卿

隨著分子生物學的深入研究，基因芯片作為基因組及后基因組時代的主要研究技術，已成為揭示藥物作用機制的重要方法。基因芯片檢測技術的前提是成功而適用的動物模型，首先需要獲得足夠的RNA檢測量，所以成功的造模方法是研究課題成敗的關鍵所在。下面就我們近期進行的結腸癌肝轉移的造模方法總結如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

4～6周齡體質量20～24g的BALB/C小鼠雄性（♂）81只，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號：京動許字（2000）第004號總049號，在Ⅱ級動物實驗室飼養。

1.1.2 瘤株

小鼠結腸癌C26細胞株（美國引進，廣安門醫院腫瘤實驗室惠贈）。經3次皮下接種傳代后，無菌條件下摘取瘤體，生理鹽水洗滌，剪成小塊，勻漿，離心后取沉淀，反復3次，培養于10%新生牛血清和RPMI1640培養液（含青霉素100U/mL、鏈霉素100U/mL），置37℃、含5%CO2培養箱中3d，每日換液。將細胞液機械吹打成單個細胞，離心取沉淀，加生理鹽水調整細胞濃度為7×105/mL，觀察細胞活力＞95%，備用。

1.2 方法

1.2.1 脾臟注射切脾法

隨機選取39只小鼠稱重，采用0.5%的戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔內注射麻醉，3～5min麻醉成功后，用膠布固定小鼠于手術臺上。安爾碘皮膚消毒，左側腋后線肋緣下縱行切口，長0.5～1cm，進腹后于腹外側找到柳葉狀脾臟，牽出腹腔外，用1mL注射器從脾下極進針，將瘤細胞液0.2mL注射于脾內，拔針后，酒精棉球按壓針眼，輕輕按揉脾臟5min，使瘤細胞經脾靜脈進入肝臟，注射區蒼白隆起消失后，結扎脾蒂，切除脾臟，查無出血，依次間斷縫合肌肉、皮膚關腹。術后繼續在Ⅱ級動物實驗室飼養。

1.2.2 脾臟注射保脾法

造模小鼠42只稱重，采用0.5%的戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔內注射麻醉，3～5min麻醉成功后，用膠布固定小鼠于手術臺上。安爾碘皮膚消毒，左側腋后線肋緣下縱行切口，長0.5～1cm，進腹后于腹外側找到柳葉狀脾臟，牽出腹腔外，用1mL注射器從脾下極進針，將瘤細胞液0.2mL注射于脾內，拔出針頭后酒精棉球壓迫注射部位1～2min，查無出血，依次間斷縫合肌肉、皮膚關腹。

造模后死亡1只，考慮失血過多致死。

2 結 果

造模后15d內自然死亡小鼠35只，切脾組21只，保脾組14只，于第12天處死小鼠23只，切脾組8只，保脾組15只，第15天將剩余小鼠22只全部處死，切脾組10只，保脾組12只。切脾小鼠自然生存期11～15d，平均（13.05±0.71）d，保脾小鼠自然生存期9～15d，平均（11.64±1.49）d。

尸檢小鼠肝臟均有轉移，轉移率為100%。切脾小鼠肝各葉皆布滿大小不一的瘤結節，大部分小鼠肝臟無正常肝組織，完全被腫瘤占據，肝重多3.5g以上，保脾小鼠脾內腫瘤巨大，肝內轉移灶較少，肝臟形態、重量無明顯變化，大多數為散在的米粒大小瘤結節轉移，最大瘤結節為0.8×0.5cm，肝重多為0.8g左右（圖1）。

3 討 論

圖1 小鼠結腸癌肝轉移造模對比

結腸癌是一種常見惡性腫瘤，發病率在世界范圍內為惡性腫瘤的第3位，肝臟是結腸癌常見的轉移部位，15%～25%的患者在確診已發生肝轉移，20%～35%的患者轉移灶僅出現在肝臟，50%～70%的晚期結腸癌患者出現肝轉移。結腸癌肝轉移是結腸癌患者死亡的主要原因，因此，結腸癌肝轉移的治療日益受到臨床的重視。而尋找合適的動物模型可以為結腸癌肝轉移的研究提供良好的實驗基礎。

Kozlowski等[1]提出研究腫瘤肝臟轉移的最佳模式是從脾臟內植入瘤細胞，許勤等[2]同法用BALB/C小鼠脾內注射小鼠結腸腺癌細胞（CT26）造模成功率100%。左國華等[3]用BALB/C-nu/nu小鼠脾內注射人結腸癌低分化腺癌細胞株LS174T制造肝轉移模型，成功率也達到100%。韓斌[4]將小鼠結腸癌細胞（CT26）懸液接種于615小鼠脾被膜下建立結腸癌肝轉移模型，結果肝轉移發生率為93.33%。

脾臟注射瘤細胞液造模模擬了結腸癌根治術后血行轉移肝臟的途徑和過程，造模成功率高。脾臟注射后保脾小鼠肝轉移率為100%，但是，腫瘤多為散在的瘤結節，數目較小、體積較小，可能無法滿足較大組織量的檢測要求。同時，由于脾內腫瘤較大，小鼠常較早死于脾內腫瘤，無法滿足多個時間點檢測的需要。脾臟注射瘤細胞液切脾法則可獲得轉移腫瘤組織較多，能滿足各種檢測方法取材的需要，尤其是基因芯片檢測取材需近500mg組織，且小鼠生存時間較保脾組長，可以滿足多個時間點的取材。另外，在切斷脾蒂前將脾臟完全暴露，便于進針注射及結扎、切斷脾蒂，避免了脾臟大出血，減少動物造模的死亡率。

因此，小鼠結腸癌肝轉移模型的建立以脾臟注射瘤細胞液后切脾法最佳，尤其適用于結腸癌肝轉移的基因組表達譜研究，可同時滿足檢測組織量及選取多個時間點的要求。

[1] Kozlowski JM,Fidler IJ,Campbell DE,et al.Metastatic behavior of human tumor cell lines grown in the nude mouse[J] .Cancer Res,1984,44(8):3522-3529.

[2] 許勤,吳文溪,馬利民,等.小鼠結腸腺癌肝轉移模型的建立[J] .實用癌癥雜志,2000,15(5):456-457.

[3] 左國華,葛海燕.人結腸癌裸小鼠肝轉移模型的建立[J] .中華實驗外科雜志,1999,16(4):373.

[4] 韓斌.615小鼠結腸癌肝轉移模型的建立[J] .醫藥論壇雜志,2005,26(23):26-27.