As2O3對胃癌的黏附分子、VEGF、nm23表達的影響

于齊宏 楊幼林 蔡朋朋

胃癌是我國常見的消化系統惡性腫瘤，其發病率高，早期診斷率低，中晚期時常規放療、化療效果不理想，目前尚缺乏有效的治療手段。因此，尋找新的治療藥物及治療手段，抑制腫瘤的浸潤、發展、轉移，乃是當務之急。

近年的研究熱點三氧化二砷抑制胃癌細胞生長、浸潤和轉移作用，已成功地在多種培養腫瘤細胞株的體外實驗和動物實體腫瘤中得以驗證，且對其抑制腫瘤細胞生長、浸潤和轉移分子生物學機制亦有一定程度的闡述。三氧化二砷目前應用于臨床在初治、復發、耐藥的急性早幼粒細胞白血病治療上療效顯著，且不良反應較輕，是一種相對安全有效的新藥物，這一點已獲國際共識，但是，對胃癌的臨床應用尚未見相關報道。

本實驗通過對胃癌病人短時間、小劑量三氧化二砷的應用，觀察用藥前后CD44、E-CD、VEGF、nm23的變化，探討三氧化二砷抑制胃癌生長、浸潤和轉移的機制，以期尋找治療胃癌的新途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗標本

標本是在2007年9月至2007年11月間分別取自哈爾濱醫科大學附屬第一醫院、解放軍211醫院、大慶油田總醫院的病理科的存檔蠟塊，26塊胃癌均為腺癌，術前接受三氧化二砷化療，均未接受放療。

1.1.2 實驗試劑

①蘇木素染液；②0.01mol/L PBS緩沖液；③兔抗人E-CD多克隆抗體IgG1濃縮液：購自博士德生物制劑有限公司；④鼠抗人VEGF單克隆抗體：購自北京中山生物制劑有限公司5、鼠抗人nm23單克隆抗體：購自北京中山生物制劑有限公；⑥鼠抗人CD44單克隆抗體：購自北京中山生物制劑有限公司；⑦山羊抗小鼠IgG抗體-HRP多聚體：購自北京中山生物制劑有限公司；⑧辣根過氧化物酶顯色劑DAB：購自北京中山生物制劑有限公司；⑨三氧化二砷注射液。

1.1.3 儀器及設備

①酒精燈；②電熱恒溫干燥箱；③切片機；④高壓鍋；⑤光學顯微鏡；⑥天平；⑦胃鏡。

1.2 實驗方法

①在胃鏡提取癌組織標本，并經病理證實。留取癌組織標本。②化療：對該患者應用5%葡萄糖注射液500mL中加入As2O3注射液（濃度5mmol/10mL）2支，1次/d靜脈滴注，共3d。③同一患者化療后手術中：再取組織標本。④所有組織均經10%中性甲醛固定，石蠟包埋。以4μm厚度做連續片。分別作HE染色和免疫組織化學染色。⑤采用免疫組織化學二步法分別檢測各組織中E-CD、VEGF、nm23、CD44的表達情況。免疫組織化學具體步驟如下：①將石蠟切片常規二甲苯脫蠟，梯度酒精水化；②3%過氧化氫-甲醇溶液孵育10min，阻斷內源性過氧化物酶；③石蠟切片高壓抗原修復法進行抗原修復；④滴加一抗（陰性對照以磷酸鹽緩沖液PBS代替一抗，以已知陽性反應片作為陽性對照），37℃孵化12h；⑤PBS緩沖液沖洗，5min，3次；⑥滴加山羊抗小鼠IgG抗體-HRP多聚體（PV-6000），37℃孵化20min；⑦PBS緩沖液沖洗，5min，3次；⑧DAB顯色；⑨蒸餾水沖洗3min，蘇木素復染；⑩酒精脫水，二甲苯透明，封片。

1.3 實驗指標檢測

①E-CD：一抗為兔抗人多克隆抗體IgG1濃縮液，免疫組織化學結果以化學顯微鏡觀察，陽性細胞為胞質著色棕黃色。②VEGF：一抗為鼠抗人單克隆抗體IgG1濃縮液，免疫組織化學結果以光學顯微鏡觀察，陽性細胞為胞質著色棕黃色。③nm23：一抗為鼠抗人單克隆抗體IgG2a濃縮液，免疫組織化學結果以光學顯微鏡觀察，陽性細胞為胞質著色棕黃色。④CD44：一抗為鼠抗人單克隆抗體IgG2a濃縮液，免疫組織化學結果以光學顯微鏡觀察，陽性細胞為胞質著色棕黃色。

1.4 結果判定

E-CD、VEGF、nm23、CD44表達在癌細胞胞膜和細胞質，胞質有棕黃色顆粒沉著的為陽性細胞，觀察5個具有代表性的高倍視野，計數陽性細胞數與總細胞數比值。

1.5 統計學處理

應用非參數檢驗中秩和檢驗，P＜0.05差異顯著性。

2 結 果

2.1 E-CD、VEGF、nm23、CD44在胃癌組織中的表達

化療前后E-CD在胃癌腫瘤組織中表達情況，見表1和圖3、圖4。

表1 化療前后E-CD在胃癌腫瘤組織中表達情況（%）

E-CD在術前與術后胃癌腫瘤組織中表達的比較，采用非參數秩和檢驗，結果顯示，P＜0.05，有統計學意義。E-CD在術前癌組織與術后癌組織中的表達明顯降低。

2.2 化療前后CD44在胃癌腫瘤組織中表達情況，見表2和圖1、圖2。

表2結果顯示，CD44術前癌組織與術后癌組織中表達的比較采用非常熟秩和檢驗，P＜0.05，有統計學意義。CD44在術前癌組織與術后癌組織中的表達明顯降低。

表2 化療前后CD44在胃癌腫瘤組織中表達情況（%）

2.3 化療前后VEGF在胃癌腫瘤組織中表達情況，見表3和圖7、圖8。

表3 化療前后VEGF在胃癌腫瘤組織中表達情況（%）

表3結果顯示，VEGF在術前癌組織與術后癌組織中表達的比較，采用非參數秩和檢驗，P＜0.05，有統計學意義。VEGF在術前癌組織中與術后癌組織中的表達明顯降低。

2.4 化療前后nm23在胃癌腫瘤組織中表達情況，見表4和圖5、圖6。

表4 化療前后nm23在胃癌腫瘤組織中表達情況（%）

表4結果顯示，nm23在術前癌組織與術后癌組織中的比較采用非參數秩和檢驗，P＜0.05，有統計學意義。nm23在術前癌組織與術后癌組織中的表達明顯升高。

3 討 論

胃癌是常見的惡性腫瘤，多數患者在診斷時已達中晚期，無法手術；而目前治療中晚期胃癌，對于多數患者來說藥物單一，且療效較差。三氧化砷注射液是我國自行開發研制的抗癌新藥，近年來在急性早幼粒細胞白血病的治療中已取得明顯突破，引起世人矚目。目前已有一些三氧化二砷注射液治療實體瘤的實驗研究報道，但是有關臨床研究較少，僅見原發性肝癌[1-3]、膽囊癌[4]、口腔鱗癌[5]和食管癌[6]等。

腫瘤細胞的侵襲與轉移是十分復雜的生物學現象，是多因素、多

階段的過程，與許多基因的異常表達有關。目前體外癌細胞培養和動物模型研究表明，E-CD、VEGF、CD44、nm23是這些調控因子中較為重要的，在癌的侵襲與轉移中發揮著重要的作用。因此，促使CD44、E-CD、VEGF、nm23在癌組織中的正常表達有利于成為抑制腫瘤的轉移的新途徑。本實驗中，主要對胃癌的患者短時間，小劑量的應用三氧化二砷化療，研究三氧化二砷對腫瘤組織中E-CD、VEGF、CD44、nm23的作用，探討三氧化二砷抗腫瘤侵襲和轉移的作用。

3.1 三氧化二砷對腫瘤組織中E-CD、CD44的作用

E-CD、CD44同屬于黏附分子，在腫瘤侵襲轉移的各個環節中都涉及細胞黏附作用。腫瘤細胞從原發瘤體脫離，與瘤細胞間黏附力降低有關；腫瘤細胞在血管內形成同質或異質性瘤栓，亦是黏附作用的結果；在侵襲過程中腫瘤細胞和血管內皮及內皮下基底膜的黏附；以及腫瘤細胞穿出血管壁與宿主細胞的黏附等。這些黏附作用是位于細胞表面的細胞黏附分子介導的。

3.1.1 三氧化二砷對胃癌腫瘤組織中CD44的作用

CD44屬于黏附分子家族透明質酸受體類，CD44的主要配體為透明質酸（HA），此外，層粘連蛋白、纖維鏈接蛋白的肝素結構域以及Ⅰ型和Ⅳ型膠原等也可作為其配體。大量研究表明，它的表達與多種腫瘤的浸潤和轉移有關。CD44分布十分廣泛，除少量分布于增生分裂功能旺盛的正常組織（如造血組織）外，大量表達于癌前病變和惡性腫瘤。CD44高表達，促進癌的侵襲和轉移。

本實驗結果顯示，術前癌細胞與術后癌細胞中CD44表達的比較采用非參數秩和檢驗，有明顯統計學意義（P＜0.05）。化療前后CD44在胃癌腫瘤組織中表達顯著降低，提示三氧化二砷對胃癌腫瘤組織中CD44有抑制作用。

3.1.2 三氧化二砷對胃癌腫瘤組織中E-CD的作用

E-CD是介導細胞與細胞間互相黏附的同質型鈣依賴型跨膜蛋白。E-CD介導的細胞黏附系統失活減少細胞與細胞間黏附從而導致了細胞極性的丟失及組織結構的溶解、破壞。故而E-CD介導的細胞黏附系統在腫瘤的侵襲及轉移中起著重要作用。國內為大量文獻報道，E-CD的表達缺失與腫瘤的侵襲及轉移相關。

本實驗結果顯示，化療前后E-CD在胃癌腫瘤組織中表達降低。提示三氧化二砷對胃癌腫瘤組織中E-CD無作用。

目前有明顯報道，三氧化二砷能降低細胞質內游離的鈣離子，而E-CD為鈣依賴型跨膜蛋白，三氧化二砷化療后，E-CD無意義可能與三氧化二砷化療時間不夠，應用劑量小，未能引起腫瘤組織的去甲基化，及調節E-CD多肽酶的變化有關。另外，也可能與三氧化二砷代謝導致E-CD的分布異常有關，而出現了上述結果。三氧化二砷對胃癌腫瘤組織中E-CD的表達影響有待于進一步研究。

3.2 三氧化二砷對胃癌腫瘤組織中VEGF的作用

腫瘤新生血管的形成，不僅為腫瘤的增長提供營養和氣體交換，而且也是腫瘤細胞浸潤、轉移的直接途徑。腫瘤血管的起動是由腫瘤細胞分泌的促內皮細胞增殖和遷移的多種血管生長因子所誘發，諸如血管內皮生長因子通過內皮細胞上的特異性受體刺激血管內皮細胞增殖和毛細血管攀形成，并產生PAs和膠原酶。這不僅有利于血管生成，而且還促使癌細胞脫落進入血管或擴散至鄰近纖維蛋白和結締組織基質，為腫瘤浸潤、轉移創造條件。VEGF增加血管通透性導致血漿蛋白和纖維蛋白外滲至細胞外間隙，外滲的纖維蛋白與其他蛋白質如纖維連結蛋白等凝結成纖維凝膠，為成纖維細胞、內皮細胞和其他細胞移動、侵入提供暫時的基質成分，并最終將它轉化為血管化的連接組織。

本實驗結果顯示，化療前后VEGF在胃癌腫瘤組織中表達率分別為46.2%和3.8%。術前癌組織與術后癌組織中VEGF表達的比較采用Fisher確切概率法，組間差異有統計學意義（P＜0.05）。化療前后VEGF在胃癌腫瘤組織中表達率顯著降低。提示三氧化二砷對胃癌腫瘤組織中有VEGF抑制作用。

考慮三氧化二砷對胃癌腫瘤組織中VEGF抑制作用可能是通過以下途徑。國內外大量文獻報道三氧化二砷誘導腫瘤細胞凋亡。三氧化二砷能夠調節凋亡相關基因H-ras、K-ras、p53的表達。H-ras、K-ras、p53對VEGF有調控作用[7,8]。因此，H-ras、K-ras、p53表達上調抑制VEGF的表達。

3.3 三氧化二砷對胃癌腫瘤組織中nm23的作用

nm23是一個重要的腫瘤轉移抑制基因，nm23定位于人17號染色體長臂遠端，它可以抑制參與細胞轉移連鎖反應中蛋白質或直接作用于轉移相關基因的RNA或DNA。nm23基因的低表達已經在多種高轉移腫瘤中被證實。通過分析乳腺癌、卵巢癌、肝癌、惡性黑色素瘤等均發現[9-12]，nm23基因缺乏及其產物低表達與疾病進展及高轉移潛力呈正相關，且預后也差。

本實驗結果顯示，化療前后VEGF在胃癌腫瘤組織中表達率分別為11.5%和61.5%。術前癌組織與術后癌組織中VEGF表達的比較采用Fisher確切概率法，組間差異有統計學意義（P＜0.05）。化療前后VEGF在胃癌腫瘤組織中表達率顯著增高。提示三氧化二砷對胃癌腫瘤組織中有調節nm23作用。

三氧化二砷作為一種細胞毒藥物，長期以來被認為能抑制細胞DNA的合成，干擾細胞代謝，致染色體畸變或損害細胞基因。三氧化二砷對癌細胞的效應是廣泛的，可引起多種腫瘤細胞的多種基因的表達改變。本實驗提示，三氧化二砷對胃癌腫瘤的表達均有影響，證實了其作用的廣泛性。作為癌組織的調控因子，參與腫瘤的浸潤與轉移。三氧化二砷對它們表達的影響，從而抑制了腫瘤的浸潤與轉移，從一個新角度探討三氧化二砷的抗腫瘤的作用。初步提示了三氧化二砷的抗腫瘤作用除了傳統的抗凋亡，抑制腫瘤細胞增殖作用外，可能還與抑制腫瘤的浸潤及轉移有關。并為三氧化二砷抗腫瘤提供新的依據。

4 結 論

本實驗中，主要對胃癌的患者短時間、小劑量的應用三氧化二砷化療，研究三氧化二砷對胃癌腫瘤組織中E-CD、VEGF、CD44、nm23的作用，得出以下結論：①三氧化二砷對胃癌腫瘤組織中CD44表達有抑制作用。②三氧化二砷對胃癌腫瘤組織中E-CD的表達有抑制作用。③三氧化二砷對胃癌腫瘤組織中VEGF的表達有抑制作用。④三氧化二砷對胃癌腫瘤組織中nm23的表達增高。

三氧化二砷對胃癌腫瘤組織中VEGF、CD44抑制作用，nm23促進作用，推測出三氧化二砷抑制胃癌腫瘤組織的浸潤及轉移。

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