不離心直接上游法優化精子用于夫精宮腔內人工授精

馬征兵，閔保華，張永奇 ，羅亞寧

（1.河南省安陽市婦幼保健院生殖科,河南安陽 455000；2.第四軍醫大學唐都醫院生殖醫學中心,陜西西安 710038）

既往筆者探討了多種精子優化法可選擇應用于夫精宮腔內人工授精術前精液的體外處理，其中洗滌上游法適用于精液常規檢查大致正常者[1]。近來筆者采用了一種新的精子優化法，即不離心直接上游法，實踐表明，該法同洗滌上游法一樣，可成功用于夫精宮腔內人工授精前精液的體外處理，現報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗材料

收集的數據來自安陽市婦幼保健院生殖科和第四軍醫大學唐都醫院生殖醫學中心于2009年7月～2009年12月擬行夫精宮腔內人工授精丈夫精液體外處理前后的實驗記錄，丈夫精液常規檢查大致正常者90例共130個周期。采用2種上游法按照隨機原則對這90例不孕不育患者共130個周期進行精液體外優化，其中洗滌上游法70個周期，不離心直接上游法60個周期。標本采集時囑丈夫禁欲3～7 d，于授精日手淫將精液完整取于一次性無毒無菌取精杯內，放無菌超凈工作臺內室溫下直到精液完全液化后備用。

1.2 儀器與試劑

CO2培養箱（美國Thermo公司），超凈工作臺（蘇州蘇凈公司），WLJY-9000型偉力彩色精子質量檢測系統 （北京偉力公司）；Diff-Quik快速染色試劑盒（廣東友寧公司），Q-HTF精子洗滌和培養液（美國ZDL公司），G-IVFTM-plus精子處理和受精液（瑞典Vitrolife公司）。

1.3 精子動態與形態學檢查

精子優化前，將已液化的精液按WHO實驗室標準進行精液常規分析[2]；精子動態學主要參數（密度、活率、活力分級）采用WLJY-9000型偉力彩色精子質量檢測系統軟件進行計算；精子形態學主要參數（正常形態精子百分率）采用人工計數方法計算。檢查時，取0.5 ml精液加0.5 ml生理鹽水充分混勻，用巴士德吸管吸取這1 ml稀釋的精液滴片、拉薄技術制片2張，按照WHO推薦的Diff-Quik法進行染色；在光學顯微鏡油鏡（×1 000）下，每張片至少讀取200個精子，用嚴格判斷標準進行判別；人工計數正常形態及畸形精子數，最后取2張片子結果的均數。

1.4 精子優化方法

洗滌上游法：向已液化的精液內加入等體積經37℃、5%CO2平衡過的Q-HTF精子洗液，充分混勻后400×g離心10 min，留管底精子沉淀加3 ml Q-HTF精子洗液再次混勻，300×g離心6 min，去除上清液后，向底部沉淀精子上方緩慢加入1.5 ml G-IVFTM-plus液，傾斜 45°置 37℃、5%CO2培養箱孵育40 min后，用無菌巴士德吸管吸取G-IVFTM-plus上層云霧狀含精子的懸液1.0 ml，置于無菌小試管內，用可調移液器吸取5.0μl精子懸液做動態學檢查，吸取50μl精子懸液滴片、拉薄技術制片、染色做形態學檢查（方法同優化前），剩余標本待行宮腔內人工授精；不離心直接上游法：準備8～10個一次性無菌圓底試管，分別加入1ml經37℃、5%CO2平衡過的G-IVFTM-plus液，用可調移液器吸取8～10等份已液化的精液，直接緩慢地加在圓底試管底部G-IVFTM-plus液的下面，加樣時不能產生氣泡，然后將這8～10個圓底試管傾斜45°置37℃、5%CO2培養箱孵育1 h，之后用可調移液器向每個圓底試管吸取G-IVFTM-plus上層云霧狀含精子的懸液各100μl，共收集上游液0.8～1.0 ml，置于無菌小試管內，同洗滌上游法取樣做精子動態、形態學檢查，剩余標本待行宮腔內人工授精。

1.5 統計學方法

應用SPSS 11.5統計軟件進行統計學分析，數據以均數±標準差（x±s）表示，采用方差齊的成組t檢驗。

2 結果

90例共130個周期隨機采用上述2種上游法處理精液后，精子的動態學主要參數，包括密度、活率、活力分級（a+b）較處理前相比均得到明顯提高（均P＜0.05）；正常形態精子百分率與處理前比較，差異無統計學意義（P＞0.05），不離心直接上游法優化后精子的主要參數與洗滌上游法優化后精子的主要參數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 2種上游法處理精液后精子主要參數的變化（x±s）

3 討論

上游法和雙層密度梯度離心法是目前精子優化處理常用的兩種方法[3]。將精液進行離心是精液體外處理中共有的一項操作，盡管優選技術不會增加精子超微結構的損害，對精子染色體也沒有產生影響，然而包括離心等環節對精液的體外處理可能會造成精子的物理損傷并形成損害性的過氧化物或其他氧自由基[4-5]，這些有害物質會造成精子DNA的損傷并影響精子染色質的完整性[6]。有報道不育男性精子染色體的畸變率明顯高于體細胞染色體[7]，這可能與采取輔助生殖技術后有較高的不良妊娠結局密切相關[8]。因此，在保證臨床妊娠率的前提下，如何使精子盡量處在一種接近生理狀況下與卵子受精是值得探討的一個問題。

本文介紹的不離心直接上游法，正是出于上述因素考慮而采取的一種精子體外優化的方法。由于上游法同密度梯度離心法相比，回收精子數量較低[1]，為了在不離心濃縮精子的情況下能夠回收到相當數量活力好的精子，筆者將常規檢查大致正常并且已充分液化的精液分為8～10等份，分別加樣在G-IVFTM-plus受精液的下面，這樣，有利于精液與受精液充分接觸，相當于縮短了精子與受精液之間的距離，擴大了精子與受精液接觸的面積；同時又延長了精子上游的時間，讓活力好的精子充分上游。本實驗結果表明，在不離心的情況下，同樣可以回收到密度較高、活力較好的精子，與經過離心的洗滌上游法相比，精子動態與形態學主要參數的差異無統計學意義（P＞0.05）。此外，本研究發現，采用這2種上游法優化精子后與優化前相比，正常形態精子百分率比較，差異也無統計學意義（P＞0.05），表明這2種上游法均不能有效去除畸形精子，可能是上游法使一些活力較好的畸形精子都得到了上游。盡管不離心直接上游法同時也增加了試劑和耗材的消耗，然而此方法減少了精液離心這一環節可能對精子造成的不利影響，并且縮短了精子在CO2培養箱外放置的時間，最終可以取得與經過離心的洗滌上游法同樣的優化效果。另外，對那些少精子癥而擬行夫精宮腔內人工授精的患者，筆者仍然采用雙層密度梯度離心法。

總之，不離心直接上游法是完全依靠精子克服自身重力和精漿的黏滯阻力向上游動到受精液里的一種精子優化方法。本研究表明，對于常規檢查大致正常的精液標本，可以考慮采用這種方法來優化精子。以后的工作中，筆者將擴大不離心直接上游法優化精子的樣本例數，并將隨訪用此方法行夫精宮腔內人工授精后患者的妊娠率和妊娠結局。

[1]閔保華,羅亞寧,王曉紅,等.3種精子優化法處理精子行宮腔內人工授精的結局分析[J].陜西醫學雜志,2006,35(2):148-150.

[2]世界衛生組織.人類精液及精子-宮頸粘液相互作用實驗室檢驗手冊[M].谷翊群,陳振文,于和鳴,等,譯.4 版.北京:人民衛生出版社,2001:5-64.

[3]Allamaneni SS，Agarwa A，Rama S，et al.Comparative study on density gradients and swim-up pmparation techniques utilizing neat and cryopreserved spermatozoa[J].Asian JAndrol,2005,7(1):86-92.

[4]張巧玉,秦榮,常青,等.優選技術對人精子染色體及超微結構的影響[J].中華男科學,2004,10(1):29-31.

[5]王娜.活性氧類物質對精子DNA的損傷及其檢測[J].中國醫藥導報,2009,6(12):5-6.

[6]李紅,楊學農,李文平.精子DNA損傷的研究進展及臨床價值[J].中國計劃生育學雜志,2008,16(9):575-576.

[7]葛宏兵,周惠耕.2203例不育男性染色體分析[J].中華實驗外科雜志,2005,22(10):1222-1223.

[8]張青松,文波,陳敏.體外處理對精子形態的影響及妊娠結局的臨床觀察[J].中國優生與遺傳雜志,2007,15(7):83-88.