染料木黃酮脂質體的制備及其對腫瘤細胞體外增殖的抑制作用

楊春寶,丁江華,鄭章清

染料木黃酮(genistein),又名 5,7,4-三羥基異黃酮,可通過多種機制發揮抗腫瘤作用。脂質體作為一種新型藥物載體,可有效降低毒副作用,且免疫脂質體可將藥物靶向釋放到靶分子。本研究制備了染料木黃酮脂質體(GL),并以肺腺癌細胞株 A549細胞、肝癌細胞株 HepG2為實驗對象,考察 GL對腫瘤細胞體外增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Waters 600型高效液相色譜系統;DiamonsilTMC18ODS分析柱;BIO-RAD 680型酶標儀;RE-52旋轉蒸發儀;LA-950型激光粒度分析儀;VORTEX21K高速冷凍離心機。染料木黃酮標準品;MEM培養基;胎牛血清(FBS);非必需氨基酸;胰蛋白酶;乙二胺四乙酸;膽固醇;大豆卵磷脂;甲醇;四甲基偶氮唑藍;其余試劑均為國產分析純。

1.2 細胞培養 A549肺腺癌細胞株和 HepG2肝癌細胞株購于中國醫學科學院腫瘤研究所(ATCC number分別為 CCL-185和 HB-8065TM)。分別常規培養于含 10%FBS的 RPMI-1640培養基和改良MEM培養基中。培養條件：5%CO2、濕度 95%、37℃。每周傳代 2次。待細胞基本長滿后,棄去舊培養基,以適量 2.5 g/L胰蛋白酶和 0.2 g/L乙二胺四乙酸(體積比為 1∶1)混合液將細胞消化約 1 min,棄去消化液并加入適量含 10%FBS的 MEM培養基,反復吹打后制備細胞懸液,以 1∶4的比例傳代。

1.3 染料木黃酮脂質體(GL)的制備方法 超聲薄膜法制備 GL[1]。

1.4 GL對腫瘤細胞生長的影響 分別將 A549細胞和 HepG2細胞接種于 6孔細胞培養板中,每孔20 000個細胞。過夜貼壁后,實驗組加入 GL(終濃度分別為 5、20、50μmol/L),對照組補加等體積的培養基,分別于第 24、48、72、96 h取樣,臺盼藍活細胞拒染法計算各組活細胞數,繪制細胞生長曲線。于 96孔板中采用常規 MTT方法(作用 48 h),分別測定染料木黃酮及 GL對 A549和 HepG2細胞的體外增殖抑制作用,并計算 IC50。

2 結 果

2.1 GL粒度分布 將 GL適當稀釋后在激光粒度分析儀上進行測定。結果表明,脂質體平均粒徑為136.7 nm,粒徑分布范圍窄,基本符合正態分布規律。

2.2 GL對 A 549和 HepG2細胞生長的影響 GL作用較長時間后,細胞生長明顯受到抑制,且呈劑量依賴性。作用 24 h后,20μmol/L GL對 A 549和HepG2細胞的生長抑制率分別達 37%和 35%,50 μmol/LGL處理時生長抑制率可達 55%和 57%。結果見圖 1。

圖1 不同濃度 GL處理時 A549細胞(A)和 HepG2細胞(B)的生長曲線

2.3 染料木黃酮及 GL對 A549和 HepG2細胞的體外增殖抑制作用 MTT實驗結果顯示,染料木黃酮和 GL均呈劑量依賴性抑制 A549和 HepG2細胞的體外增殖;且 GL對細胞的增殖抑制作用強于游離染料木黃酮。GL對 A549和 HepG2細胞的 IC50分別為 10.46、12.34μmol/L,而游離染料木黃酮對 A549和 HepG2細胞的 IC50分別為 32.35、30.87μmol/L。結果見圖 2。

圖2 不同濃度 GL和游離染料木黃酮對 A549細胞(A)和 HepG2細胞(B)增殖作用的影響(n=3)

3 討 論

目前認為染料木黃酮具有抗腫瘤作用機制有：①染料木黃酮可與雌激素競爭結合雌激素受體,從而減輕雌激素的促細胞增殖作用,降低與雌激素有關的腫瘤發病危險性[2];②染料木黃酮是酪氨酸蛋白激酶(PTK)的強抑制劑,對 PTK的抑制作用是其抗癌效應的重要分子機制[2];③染料木黃酮可抑制拓撲異構酶Ⅱ活性,引起腫瘤細胞的 G2/M期阻滯,誘導腫瘤細胞凋亡[3];④還可誘導谷胱甘肽過氧化物酶基因表達上調[4]。染料木黃酮是一種很有潛力的腫瘤化療藥物,具有廣泛的應用前景,但其難溶于水,且具生殖內分泌毒性[5]、免疫毒性[6]、神經毒性[7]及遺傳毒性[8]等多種毒副作用,限制了該化合物的進一步開發利用。

本研究制備了染料木黃酮脂質體,并對該制劑的穩定性及對腫瘤細胞的增殖抑制作用進行了觀察,為將該化合物制備成免疫脂質體提供了實驗依據。MTT實驗結果顯示,染料木黃酮脂質體對 A 549和 HepG2細胞的體外增殖抑制作用明顯強于游離染料木黃酮,其 IC50大約是游離藥物的1/3。其機制可能與腫瘤細胞攝取脂質體中藥物的方式有關。脂質體主要通過細胞膜融合作用而被腫瘤細胞內吞,因而腫瘤細胞能有效攝取脂質體中藥物,與游離藥物進入細胞的方式相比,該方式能使腫瘤細胞內藥物攝取量增加許多倍。

為進行染料木黃酮脂質體對腫瘤細胞的體外增殖抑制作用研究,本研究中首先將制備的染料木黃酮脂質體用 0.22μm的微孔濾膜過濾,不可避免的造成了藥物的損失。分析認為,可能與粒徑較大的脂質體顆粒所能包裹的藥物分子較多有關。需進一步改善脂質體的制備工藝,以減少粒徑較大的脂質體的比例及因此造成的藥物損失。

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