高效液相色譜法測定5′-三磷酸腺苷含量

5′-三磷酸腺苷 (Adenosine triphosphate,ATP)又名腺三磷、腺嘌呤配糖三磷酸，臨床應用廣泛，是用于治療進行性肌萎縮、腦溢血后遺癥、心機能不全、心肌疾患及肝炎等疾病的輔酶類藥物，被稱為人體內的“能量貨幣”[1]。

在ATP的制備、存儲過程中，易混入或產生一磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)等雜質。ATP、ADP及AMP的結構相似、理化性質相近，因此檢測較為困難[2]。我國部標和地方標準均采用紙電泳法[3]或紙層析法[4]測定ATP含量，存在操作時間長、誤差較大、操作繁瑣的缺點。也有報道采用生物發光法測定ATP含量，但該方法不能對雜質進行分析[5]。作者采用高效液相色譜法測定ATP含量，結果令人滿意。

1 實驗

1.1 試劑和儀器

對照品：ATP二鈉(Sigma)，ADP (中國醫藥上海化學試劑公司)，AMP(中科院上海生化所東風生化技術公司)；樣品：ATP二鈉(批號：200209070,上海太平洋制藥廠)；NH3·H2O、磷酸二氫銨，分析純。

Waters 600型高效液相色譜工作系統,PDA996型二極管陣列檢測器；WFZ800-D2C型紫外可見分光光度計,北京瑞利分析儀器公司；PHS-3C型精密pH計,上海雷磁。

1.2 色譜條件

色譜條件為：XTerraTMRP18(3.9 mm×150 mm，5 μm) 色譜柱，檢測波長259 nm，柱溫(25±2)℃,流動相為0.05 mol·L-1pH值7.0的NH4H2PO4緩沖溶液，進樣量20 μL，流速1.0 mL·min-1。

1.3 ATP含量的計算

按1.2條件測定ATP、ADP和AMP的HPLC譜圖，樣品中ATP的含量依下式計算：

式中：ξ為樣品中ATP質量分數；VS為樣品液體積；AL為對照品ATP峰面積；cL為對照品溶液中ATP濃度；WS為配制樣品液中ATP質量；AS為樣品ATP峰面積。

2 結果與討論

2.1 波長的選擇

配制0.05 mol·L-1pH值7.0的NH4H2PO4緩沖溶液，用該緩沖溶液配制0.009250 g·L-1ATP對照品溶液。以NH4H2PO4緩沖溶液為參比，對ATP溶液進行紫外掃描，結果見圖1。

由圖1可知，ATP在208 nm和259 nm處有大的吸收值。由于259 nm處波峰較寬、數據較為穩定，因此選用259 nm作為檢測波長。

圖1 ATP紫外掃描圖譜

2.2 標準曲線的繪制

由于ATP、ADP、AMP在波長259 nm處都具有最大吸收且摩爾吸光系數相同，因此可用紫外分光光度法對其線性關系進行考察[6]。

準確稱取ATP對照品0.008278 g，置于100 mL容量瓶中，用0.05 mol·L-1pH值7.0的NH4H2PO4緩沖溶液定容至刻度，搖勻作為ATP對照品溶液。精密量取ATP對照品溶液0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL、4.0 mL、4.5 mL、5.0 mL,分別置5 mL容量瓶中,用NH4H2PO4緩沖溶液定容至刻度，搖勻。

以NH4H2PO4緩沖溶液為參比，測定各溶液259 nm處吸光度值A259。以A259為縱坐標、ATP濃度為橫坐標繪制標準曲線，見圖2。

圖2 ATP標準曲線

由圖2可知，ATP濃度在10～80 mg·L-1范圍內與259 nm處吸光度值呈良好線性關系，擬合線性回歸方程為：y=0.03508+24.2365x(R=0.9994)。

2.3 HPLC檢測結果

在1.2條件下ATP對照品、ADP對照品、AMP對照品和ATP樣品的HPLC檢測結果如圖3所示。溶液濃度均為20 mg·L-1。

圖3 ATP、ADP和AMP的HPLC圖譜

由圖3可知，ATP、ADP、AMP的出峰順序為ATP>ADP>AMP。主峰ATP峰的保留時間為1.4～1.5 min，較靠后的AMP峰的保留時間為3.2～3.3 min。此外，在ATP樣品的HPLC譜圖中還發現了一個Ado(腺苷)峰，其保留時間為5.6 min，該峰的出現可能與生產樣品ATP的底物有關。整個色譜檢測過程可在7 min內完成。

2.4 重復性實驗

分別取ATP對照品、ADP對照品和AMP對照品的溶液各20 mg·L-1，重復進樣3次，計算峰面積，RSD分別為0.81%、1.96%、1.28%。

2.5 方法的回收率

以20 mg·L-1的ATP對照品溶液作為外標溶液，精確量取兩管(各5 mL)外標溶液，分別加入NH4H2PO4緩沖溶液和ATP樣品溶液各5 mL，另取一管分別加入NH4H2PO4緩沖溶液和ATP樣品溶液各5 mL，進行色譜分析，每管進樣2次，計算得平均回收率為98.87%，RSD為1.02%。

2.6 樣品測定

按1.2色譜條件，精確量取樣品溶液和對照品溶液各20 μL，重復進樣3次，測得ATP含量為95.6%，RSD為0.85%。

3 結論

采用高效液相色譜法測定5′-三磷酸腺苷含量。色譜條件為：XTerraTMRP18(3.9 mm×150 mm，5 μm) 色譜柱，流動相為0.05 mol·L-1pH值7.0 的NH4H2PO4緩沖溶液，檢測波長259 nm，流速1.0 mL·min-1，柱溫(25±2)℃,進樣量20 μL。在10～80 mg·L-1范圍內，ATP濃度與259 nm處吸光度值呈良好線性關系，R=0.9994；檢測重復性較好，平均回收率為98.87%，整個色譜過程可在7 min內完成。該方法也可用于ADP和AMP的分離檢測。

參考文獻：

[1] 程敘揚，李曉玫.細胞外三磷酸腺苷的代謝及其生物學作用[J].中國病理生理雜志，1998，14(4)：438-441.

[2] 陳燕敏，姜開余，陳幼亭．三磷酸腺苷溶液的穩定性考察[J]．蘇州醫學院學報，1997，17(1)：128，130．

[3] WS1-C3-0001-89,三磷酸腺苷二鈉[S].

[4] GB 15356-94,生化試劑核苷酸測定[S]．

[5] Andreotti Peter E (Boca Raton.FL)．Device for measuring ATP[P]．USP 5 916 802,1999-06-29.

[6] 王龍耀，范利華，肖安風,等．ATP的分析方法綜述[J]．天津化工，2003，17(2)：30-33．