葡萄皮中多酚的提取及其抗氧化活性研究

葡萄加工業的廢棄物主要是葡萄籽和葡萄皮。目前葡萄籽中多酚的提取和應用已有大量的研究,而葡萄皮作為一種重要的多酚資源,其相關研究報道相對較少[1，2]。作者以葡萄皮為原料,選擇價廉易得、無毒且提取效果最優的乙醇作為溶劑，采用回流浸提法提取多酚，對葡萄皮多酚的浸提工藝進行了優化,并對其抗氧化活性進行了研究。

1 實驗

1.1 試劑及儀器

乙醇、甲醇、硫酸亞鐵、酒石酸亞鐵、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、沒食子酸、亮綠、雙氧水，均為國產分析純；實驗用水為蒸餾水。

TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；RE-52A型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；SK250HP型超聲波萃取儀，上海科導超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線的繪制

準確稱取沒食子酸0.5 g(精確到0.0001 g)，加蒸餾水溶解并移入100 mL容量瓶中，定容，得5.0 g·L-1沒食子酸標準溶液。在6支100 mL容量瓶中分別加入上述標準溶液0 mL、2 mL、4 mL、6 mL、10 mL、20 mL，用蒸餾水定容至100 mL,各吸取1 mL，測吸光度A，繪制標準曲線，見圖1。

圖1 標準曲線

1.2.2 多酚的提取

準確稱取葡萄皮粉末2 g(精確到0.0001 g)，加入一定量50%的乙醇，混合液在一定溫度水浴中浸提一定時間，趁熱過濾，用溶劑定容至25 mL，即得多酚提取液。

1.2.3 多酚浸提量的測定

準確吸取提取液1 mL，轉移至25 mL容量瓶中，加蒸餾水4 mL、酒石酸亞鐵溶液5 mL,充分混合，再用pH值7.5的緩沖溶液定容至刻度。用10 mm的比色皿在波長540 nm處，以試劑空白溶液作參比，測吸光度A，根據標準曲線，求出多酚濃度c。依下式計算多酚浸提量(ω)：

式中：V為提取液體積，mL；m為葡萄皮粉末質量，g。

1.2.4 葡萄皮多酚抗氧化活性的測定

利用亮綠褪色法測定葡萄皮多酚抗氧化活性[3]。具體方法是:在標號為1#～7#的7支比色管中各加入1.5 mL HAc-NaAc緩沖溶液(pH=3.5)、1.5 mL亮綠溶液(2×10-4mol·L-1)、2.0 mL EDTA-Fe2+溶液(20 mmol·L-1)，再向1#～6#分別加入0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL多酚提取液及1.4 mL 2% H2O2溶液；7#為對照，用蒸餾水稀釋至10 mL，搖勻，30℃下放置0.5 h，在波長632 nm處測定吸光度。按下式計算羥基自由基的清除率(S):

式中：As為2#～6#比色管吸光度；Ab為1#比色管吸光度；A0為7#比色管吸光度。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇體積分數的影響(圖2)

圖2 乙醇體積分數對多酚浸提量的影響

由圖2可知，隨著乙醇體積分數的增大，葡萄皮多酚浸提量顯著增加;但乙醇體積分數超過50%以后，繼續增大乙醇體積分數，多酚浸提量反而減少。因此，初步確定乙醇體積分數為50%。

2.1.2 浸提溫度的影響(圖3)

圖3 浸提溫度對多酚浸提量的影響

由圖3可知，浸提溫度對葡萄皮多酚的浸提量有較大影響，隨著浸提溫度的升高，多酚的浸提量迅速增加，各浸提溫度間存在顯著性差異。因此，初步確定浸提溫度為80℃。

2.1.3 浸提時間的影響(圖4)

圖4 浸提時間對多酚浸提量的影響

由圖4可知，30 min內，隨著浸提時間的延長，葡萄皮多酚浸提量逐漸增加；30 min后，多酚浸提量逐漸減少。因此，初步確定浸提時間為30 min。

2.1.4 料液比的影響(圖5)

圖5 料液比對多酚浸提量的影響

由圖5可知，隨著溶劑用量的增大，葡萄皮多酚的浸提量相應增加；當料液比(g∶mL，下同)達到1∶9時,再增大溶劑的用量，多酚浸提量增加不明顯。因此，初步確定料液比為1∶9。

2.1.5 浸提次數的影響(圖6)

圖6 浸提次數對多酚浸提量的影響

由圖6可知，隨著浸提次數的增加，葡萄皮多酚的單次浸提量逐漸減少。從節約溶劑和能源考慮，浸提2次比較適宜。

2.2 正交實驗(表1)

表1 正交實驗結果與分析

由表1可知，各因素對葡萄皮多酚浸提量影響大小依次為：浸提溫度>乙醇體積分數>浸提時間>料液比。由方差分析可知，乙醇體積分數影響顯著，浸提溫度影響特別顯著，浸提時間影響一般顯著，而料液比影響最小，所以，從節約原料考慮，選擇最佳料液比1∶9。即葡萄皮多酚的最佳浸提條件為：浸提溫度80℃、乙醇體積分數50%、浸提時間 30 min、料液比1∶9。在此條件下浸提2次，葡萄皮多酚浸提量為13.065 mg·g-1。

2.3 葡萄皮多酚的抗氧化活性(圖7)

圖7 多酚抗氧化活性

由圖7可知，葡萄皮多酚對羥基自由基有一定的清除作用。隨著葡萄皮多酚用量的增加，其清除作用逐漸增強，最后趨近于恒定。當葡萄皮多酚提取液用量為2.5 mL時,羥基自由基清除率約為55%。

3 結論

通過單因素實驗和正交實驗，確定葡萄皮多酚最優浸提工藝條件為：浸提溫度80℃、乙醇體積分數50%、浸提時間30 min、料液比1∶9(g∶mL)。在此條件下浸提2次，浸提量為13.065 mg·g-1。當葡萄皮多酚提取液用量為2.5 mL時,其對羥基自由基的清除率約為55%。

參考文獻:

[1] 馬茜,孫麗紅.亮綠褪色光度法檢測Fenton反應產生的羥自由基[J].分析試驗室,2006,25(12):11-12.

[2] Lu Yinrong,Foo L Yeap.The polyphenol constituents of grape p-omace[J].Food Chemistry,1999，65(1):1-8.

[3] 王志遠，李清彪，楊翠嫻，等.八種水果中的多酸含量及其抗氧化性[J].天然產物研究與開發，2007，19(6):1040-1043，1023.