谷胱甘肽電化學檢測方法的研究

谷胱甘肽(GSH)是細胞內最豐富的低分子量巰基化合物，在人體代謝中發揮重要的作用，包括外源化學物質解毒作用、細胞穩態的維持、輻射防護和抗氧化等[1]；且GSH的消除與人體多種疾病密切相關，如糖尿病、艾滋病和神經退行性疾病等[2～4]。現已發展了多種GSH分析檢測方法，如酶法[5,6]、熒光測定法[7]、高效液相色譜法等。但這些方法存在靈敏度和選擇性較低、需要大型儀器及復雜耗時的柱前或柱后衍生[8～10]等缺陷；而電化學方法靈敏、簡便、快速。

作者在此研究了銅(Ⅱ)和鉻(Ⅵ)兩種金屬離子在金電極上的電化學響應與GSH濃度的關系，由此建立了一種靈敏、簡便的GSH電化學檢測方法。

1 實驗

1.1 試劑及儀器

GSH，Sigma公司；其它試劑均為分析純；實驗用水為二次蒸餾水。

CHI760c型電化學工作站，上海辰華儀器公司；Mettler-Toledo DELTA 320型pH計，Mettler-Toledo Instruments(上海)Co.,Ltd.；三電極體系：裸金電極為工作電極，鉑絲電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極。文中所有電位均相對于參比電極而言。

1.2 方法

在循環伏安(CV)法掃描前，溶液均通N2除氧15 min。將金電極先用Al2O3粉末拋光，再依次用Piranha溶液[V(濃H2SO4)∶V(30% H2O2)=1∶1]、丙酮水溶液[V(丙酮)∶V(水)=1∶1]、二次蒸餾水超聲振蕩清洗，放干待用。所有測定均在室溫下進行。

1.3 GSH對銅(Ⅱ)在金電極上的電化學行為的影響

在+0.6～-0.5 V電位范圍內，對硫酸銅濃度為2.0×10-4mol·L-1的磷酸緩沖溶液(0.1 mol·L-1,pH=5.6，NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液)以100 mV·s-1的掃描速度進行CV掃描，記錄CV曲線。再加入不同濃度的GSH溶液在同等條件下進行CV掃描。

1.4 GSH對鉻(Ⅵ)在金電極上的電化學行為的影響

參照文獻[11]，分別配制0.02 mol·L-1、0.01 mol·L-1的K2Cr2O7標準溶液。準確量取K2Cr2O7標準溶液0.05 mL于5 mL量瓶中，用含0.001 mol·L-1H2SO4的0.1 mol·L-1NaNO3溶液加至刻度，搖勻，倒入10 mL燒杯中通N215 min，即為2.0×10-4mol·L-1和1.0×10-4mol·L-1的鉻(Ⅵ)溶液。將鉻(Ⅵ)溶液分別在三電極體系中掃描，記錄CV曲線，電位范圍為+0.8～-0.2 V,掃描速度為200 mV·s-1。再加入不同濃度的GSH溶液在同等條件下進行CV掃描。

2 結果與討論

2.1 GSH對銅(Ⅱ)在金電極上的電化學行為的影響(圖1)

1.2.0×10-4 mol·L-1銅(Ⅱ) 2.2.0×10-4 mol·L-1銅(Ⅱ)+1.0×10-9 mol·L-1 GSH

由圖1可以看出，2.0×10-4mol·L-1銅(Ⅱ)在約0.28 V處出現了一個還原峰，當加入GSH溶液后，峰電流下降,見表1。

表1 不同濃度GSH對銅(Ⅱ)在金電極上峰電流的抑制

銅(Ⅱ)峰電流與1.0×10-8～8.0×10-8mol·L-1范圍內的GSH濃度呈線性相關,見圖2。

圖2 GSH濃度與2.0×10-4 mol·L-1銅(Ⅱ)在金電極上的還原峰電流的線性關系圖

其線性回歸方程為y=-0.1321x+3.4262，R=0.9822，檢測限為1.0×10-9mol·L-1。

隨掃描速度(10 mV·s-1、20 mV·s-1、50 mV·s-1、100 mV·s-1、200 mV·s-1)的加快，2.0×10-4mol·L-1銅(Ⅱ)+7.0×10-4mol·L-1GSH溶液還原峰電流呈線性增加(圖3)。表明銅(Ⅱ)在GSH存在下的電化學行為是一個受吸附控制的過程。

圖3 2.0×10-4 mol·L-1銅(Ⅱ)+7.0×10-4 mol·L-1 GSH溶液在金電極上的還原峰電流與掃描速度的線性關系圖

2.2 GSH對鉻(Ⅵ)在金電極上的電化學行為的影響(圖4)

1.2.0×10-4 mol·L-1鉻(Ⅵ) 2.2.0×10-4 mol·L-1鉻(Ⅵ)+1.0×10-11 mol·L-1 GSH

由圖4可以看出，2.0×10-4mol·L-1鉻(Ⅵ)在約0.25 V處出現了一個還原峰，當加入GSH溶液后，峰電流下降，見表2。

鉻(Ⅵ)峰電流與1.0×10-11～7.0×10-11mol·L-1范圍內的GSH濃度呈線性相關，見圖5。

表2 不同濃度GSH對鉻(Ⅵ)在金電極上的峰電流的抑制

圖5 GSH濃度與2.0×10-4 mol·L-1鉻(Ⅵ)在金電極上的還原峰電流的線性關系

其線性回歸方程為y=-0.969x+8.357，R=0.9813，檢測限為1.0×10-11mol·L-1。楊培慧等[11]報道在1.0×10-4mol·L-1的鉻(Ⅵ)溶液中加入不同濃度GSH進行CV掃描，GSH檢測限為1.0×10-9mol·L-1，線性范圍為7.0×10-8～1.0×10-9mol·L-1，線性回歸方程為y=-55.063x+5.216，R=0.9526。可見，加大鉻(Ⅵ)的濃度，可顯著提高GSH的檢測限。

隨掃描速度(200～1000 mV·s-1)的加快，1.0×10-4mol·L-1鉻(Ⅵ)+2.0×10-5mol·L-1GSH溶液還原峰電流呈線性增加(圖6)。表明鉻(Ⅵ)在GSH存在下的電化學行為是一個受吸附控制的過程，與文獻[11]報道結果一致。

3 結論

首次以銅(Ⅱ)的還原峰為信號，建立了GSH的間接檢測方法;并通過增大鉻(Ⅵ)的濃度，極大地提高了以鉻(Ⅵ)的還原峰為信號的GSH間接檢測方法的檢測限。從而建立了一種靈敏、簡便的GSH電化學檢測方法。

圖6 1.0×10-4 mol·L-1 鉻(Ⅵ)+2.0×10-5 mol·L-1 GSH溶液在金電極上的還原峰電流與掃描速度的線性關系

參考文獻：

[1] Halliwell B,Gutterridge J M C.In Free Radicals in Biology and Medicine(3rd ed)[M].Oxford:Oxford University Press,1999:163-179.

[2] Murakami K,Kondo T,Ohtsuka Y et al.Impairment of glutathione metabolism in erythrocytes from patients with diabetes mellitus[J].Metabolism,1989,38(8):753-758.

[3] Sprietsma J E.Cysteine,glutathione (GSH) and zinc and copper i-ons together are effective,natural,intracellular inhibitors of (AIDS) viruses[J].Medical Hypotheses,1999,52(6):529-538.

[4] Schulz J B,Lindenau J,Seyfried J,et al.Glutathione,oxidative stress and neurodegeneration[J].European Journal of Biochemistry,2000,267(16):4904-4911.

[5] Tietze F.Enzymic method for quantitative determination of nano-gram amounts of total and oxidized glutathione:Applications to mammalian blood and other tissues[J].Analytical Biochemistry,1969,27(3):502-522.

[6] Griffith O W.Determination of glutathione and glutathione disulfi-de using glutathione reductase and 2-vinylpyridine[J].Analytical Biochemistry,1980,106(1):207-212.

[7] Hissin P J,Hilf R A.A fluorometric method for determination of oxidized and reduced glutathione in tissues[J].Analytical Biochemistry,1976,74(1):214-226.

[8] Velury S,Howell S B.Measurement of plasma thiols after derivatization with monobromobimane[J].Journal of Chromatography,1988,424(1):141-146.

[9] Newton G L,Dorian R,Fahey R C.Analysis of biological thiols:Derivatization with monobromobimane and separation by reverse-phase high-performance liquid chromatography[J].Analytical Biochemistry,1981,114(2):383-387.

[10] Toyo′oka T,Imai K.High-performance liquid chromatography and fluorometric detection of biologically important thiols,derivatized with ammonium 7-fluorobenzo-2-oxa-1,3-diazole-4-sulphonate (SBD-F)[J].Journal of Chromatography,1983,282:495-500.

[11] 楊培慧，趙秋香，蔡繼業.鉻(Ⅵ)存在下谷胱甘肽的電化學檢測[J].中國生化藥物雜志，2004， 25(5)：273-275.