VEGF、bFGF低頻超聲透皮給藥系統對豬超長筋膜皮瓣存活的影響

呂 川 陶 然 張敬德 宋建星 王曉云 楊 超

VEGF、bFGF低頻超聲透皮給藥系統對豬超長筋膜皮瓣存活的影響

呂 川 陶 然 張敬德 宋建星 王曉云 楊 超

目的應用VEGF和bFGF，以透皮低頻超聲導入的無創給藥方法，比較單一藥物和聯合用藥對豬超長寬比例筋膜皮瓣成活率及其微循環的影響，為擴大超長寬比例筋膜皮瓣的臨床應用奠定實驗基礎。方法選用10只豬為實驗動物。在豬背部兩側設計3 cm×15 cm的筋膜皮瓣，分為空白超聲對照組、超聲導入VEGF組、超聲導入bFGF組、注射VEGF+bFGF聯用組、超聲導入VEGF＋bFGF聯用組等5組。術后10 d，測量皮瓣成活面積，測定毛細血管密度以及表達指數，并進行定量分析。結果超聲導入VEGF＋bFGF聯用組皮瓣成活率、毛細血管密度及表達指數等，均明顯優于其他4組，差異有顯著性（P＜0.01）。結論VEGF和bFGF經皮聯合低頻超聲介導給藥應用于豬超長寬比例筋膜皮瓣，可顯著提高皮瓣的成活率。

血管內皮生長因子堿性成纖維生長因子低頻超聲經皮給藥超長皮瓣筋膜皮瓣

臨床上，組織缺損創面極其常見，早期進行良好的組織覆蓋是修復缺損創面的重要條件。筋膜皮瓣，是最常用的一種修復方法，但由于其血供特點，長寬比例通常不能超過3∶1，限制了其在臨床的應用。提高超長寬比例筋膜皮瓣的成活率可以提高其在臨床的應用。本研究采用血管內皮細胞生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）和堿性成纖維細胞生長因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF），借助低頻超聲透皮導入系統的無創給藥方法，應用于超長寬比例的筋膜皮瓣，觀察皮瓣的成活率及其微循環的變化，以擴大超長寬比例筋膜皮瓣在臨床的應用。

1 材料和方法

1.1 動物及分組

選用10只豬為實驗對象。在背部兩側對稱設計3 cm×15 cm的筋膜皮瓣，方向與軀干縱軸垂直，每側分成5組：A組為空白超聲對照組，予低頻超聲處理；B組為低頻超聲經皮導入VEGF組；C組為低頻超聲經皮導入bFGF組；D組注射VEGF＋bFGF，于缺血部位多點注射，3次/日；E組以低頻超聲經皮導入VEGF＋bFGF。低頻超聲使用功率為20 kHz/3 W·cm2，每次15 min，3次/日。自手術之日起各組按設計連續處理5 d。術后每日觀察皮瓣顏色、質地、溫度、術后腫脹情況等。術后10 d觀察皮瓣成活情況。

1.2 主要試劑和儀器

重組人VEGF165和重組人bFGF（PEPROTECH公司，美國）。低頻超聲導入儀BM-628型，MIQAS醫學圖像定量分析系統，Leica DMRXA2研究型全自動顯微鏡，OLYMPUS BH2生物顯微鏡。

1.3 觀察指標

1.3.1 皮瓣存活面積及成活率

術后10 d取材，發黑干燥區域為壞死區域。用透明硫酸紙準確描繪各組皮瓣形態，壞死區域涂黑。利用CMIAS-2001A真彩色圖像分析系統計算透明紙上染黑區與未染黑區的灰度值，精確測量皮瓣的成活面積與總面積，并計算成活率。

1.3.2 毛細血管密度測定

切取組織標本，按照近、中、遠各1/3等分為3份，每塊組織再分為4等份，各切片1張行HE染色，光鏡下觀察組織學變化。在100倍光鏡下每張切片隨機選擇12個視野進行毛細血管計數，計算出組織中毛細血管的密度（個/cm2），統計分析中端和遠端1/3的密度。

1.3.3 人抗VEGF和人抗bFGF免疫組化熒光染色

每條皮瓣中點處取材，制成石蠟標本，連續切片2張，1張行人抗VEGF染色，另1張行人抗bFGF染色。染色后每張切片均在生物顯微鏡下拍照，對陽性結果進行定量分析，測定標本陽性面積和光密度，計算出陽性指數。

1.4 統計學方法

利用SPSS 13.0統計分析軟件進行多樣本方差分析，P＜0.01為差異有顯著性。

2 結果

2.1 皮瓣成活率

各組間存在顯著差異，E組皮瓣存活率較其他4組高，且有顯著性差異（P＜0.01）（表1，圖1）。

圖1 各組皮瓣存活情況

2.2 毛細血管密度測定

2.2.1 中端1/3毛細血管密度

E組皮瓣存活率較A組及B、C組高（P＜0.01），但與D組無差異（P＞0.05）（表2）。

表1 各組皮瓣存活率比較

表2 各組中端1/3毛細血管密度比較

2.2.2 遠端1/3毛細血管密度

A組皮瓣壞死，數據缺如。E組皮瓣存活率明顯高于其他3組（P＜0.01）（表3）。

表3 各組遠端1/3毛細血管密度比較

2.3 VEGF、bFGF表達陽性指數的統計學分析

按α=0.05水準，E組VEGF、bFGF的表達均高于其他各組（P＜0.01）（表4、5）。

表4 各組皮瓣VEGF陽性指數比較

表5 各組皮瓣bFGF陽性指數比較

3 討論

超聲透皮給藥，是指超聲可以增強包括大分子藥物在內的許多藥物的透皮傳輸。1954年，最早報道了用超聲成功導人氫化可的松藥膏治療手指關節的多發性關節炎[1]，之后一系列實驗證明超聲對很多藥物的滲透是有效的[2]，且低頻超聲（f＜100 kHz）提高皮膚通透性的效果最佳[3]。當低頻超聲用于透皮給藥時，空化作用是其最主要的機制[4]。它具有其他給藥方式不可比擬的優點：①在皮瓣局部存在血運障礙時，靜脈或口服等全身給藥方法使藥物很難隨血液流動到達缺血部位；透皮給藥將藥物直接作用于缺血部位，可使局部迅速達到有效血藥濃度。②適用藥物較廣，不限于小分子藥物或水溶物質等，大分子蛋白如胰島素、VEGF等亦可使用。③可使藥物在全身或局部長時間產生較恒定的血藥濃度，且可調控，從而優化藥效，減輕不良反應。④與注射給藥和靜脈給藥相比，可避免長期反復注射帶來的疼痛，還可避免局部或血路感染的潛在危險。⑤與口服給藥相比，大分子蛋白類藥物避免了胃腸道降解的過程，大大提高了生物效價。⑥應用安全，超聲停止后皮膚屏障功能即可迅速恢復。

VEGF的主要生物學功能是促進血管內皮細胞增殖，具有刺激內皮細胞增殖、遷移、發芽作用，還具有增強血管通透性的作用[5]。bFGF是目前已知最強的促細胞生成因子，誘導內皮細胞萌芽、增殖，增加血管通透性[6-7]。兩者聯合應用的優勢在于VEGF和bFGF都是血小板相關生長因子，它們共同維持血管內皮細胞的成活和增殖[8-9]，可以協同地促血管生成，使促血管作用更強，并形成差異性互補，使缺血區快速血管化，以達到臨床治療的目的[10－12]。用兩者共同刺激體外培養的毛細血管內皮細胞，在同樣的條件下，其細胞數目要比單獨用任何一種時多2～8倍[13]。Ley等[14]研究發現，當bFGF與VEGF劑量在3∶1時所產生的協同效應最強。本研究證實，同等效價的兩種藥物經低頻超聲聯合應用，較之于單獨應用或聯合注射給藥，能夠更加有效地促進內皮細胞增殖，進而增大皮瓣成活面積、擴大筋膜皮瓣的長寬比例。另外，在實際應用中，通過給藥系統，僅在局部小劑量應用，安全性較高；可以較長時間持續給藥，避免因藥物的半衰期過短而導致的血藥濃度無法維持。

目前，在動物實驗研究中證實低頻超聲經皮給藥具有良好的安全性和有效性，然而各類動物皮膚的通透性、屏障作用以及對超聲產生的能量耐受敏感度與人類皮膚均存在差異，需進一步研究以確定不同藥物的最佳使用頻率。另外，低頻超聲經皮給藥系統仍需基礎、臨床和醫用工程學三者的緊密結合，實現儀器的專門化、實用化、微型化，以利于超聲透皮給藥的臨床推廣和應用。我們相信，本方法的日趨成熟，將使超長寬比例筋膜皮瓣的臨床應用范圍更加廣泛，為各種組織缺損的修復提供更加簡單、有效的解決途徑。

[1]楊云松,彭紅云,章國林,等.透皮控釋給藥研究[J].高分子通報. 2002,1:49-56.

[2]Mitragotri S,Kost J.Low-frequency sonophoresis:a review[J]. Advaneed Drug Delivery Reviews,2004,56(5):589-601.

[3]Boucaud A,Garrigue MA,Machet L,et a1.Effect of sonication parameters on transdermal delivery of insulin to hairless rats[J]. J Control Release,2002,81(1-2):113-119.

[4]屠熙,尹芹芹,張文勝,等.低頻超聲透皮給藥的研究進展與應用[J].生物醫學工程學雜志,2008,25(6):1474-1478.

[5]何艷,曹以誠.VEGF與腫瘤血管生成及其在抗腫瘤藥物開發中的應用[J].生命科學,2008,2:222-224.

[6]Duffy FJ Jr,Maitz PK,Hergrueter CA,et al.Maximizing flap survival in a prefabrication model using exogenous and endogenous bFGF: a new approach[J].Microsurgery,1996,17(4):176-179.

[7]Fujihara Y,Koyama H,Ohba M,et al.Controlled delivery of bFGF to recipient bed enhances the vascularization and viability of an ischemic skin flap[J].Wound Repair Regen,2008,16(1):125-131.

[8]Wakisaka N,Pagano JS.Epstein-Barr virus induces invasion and metastasis factors[J].Anticancer Res,2003,23:2133-2138.

[9]Eriksson K,Magnusson P,Dixelius J,et a1.Angiostatin and endostatin inhibit endothelial cell migration in response to FGF and VEGF without interfering with specific intracellular signal transduction pathways[J].FEBS Len,2003,536:19-24.

[10]Lang I,Hoffmann C,Olip H,et a1.Differential mitogenic responses of human macrovascular and microvascular endothelial cells to cytokines underline their phenotypic heterogeneity[J].Cell Prolif, 2001,34:143-155.

[11]Tille JC,Pepper MS.Mesenchymal cells potentiate vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis in vitro[J].Exp Cell Res,2002, 280:179-191.

[12]Trivier E,Kurz DJ,Hong Y,et al.Differential regulation of telomerase in endothelial cells by fibroblast growth factor-2 and vascular endothelial growth factor-a:association with replicative life span [J].Ann N Y Acad Sci,2004,1019:111-115.

[13]Pepper MS,Mandriota SJ,Jeltsch M,et a1.Vascular endothelial growth factor(VEGF)-C synergizes with basic fibroblast growth factor and VEGF in the induction of angiogenesis in vitro and alters endothelial cell extracellular proteolytic activity[J].J Cell Physiol, 1998,177:439-452.

[14]Seghezzi G,Patel S,Ren CJ,et a1.Fibroblast growth factor-2 (FGF-2)induces vascular expression in the endothelial cell of forming capillaries:an autocrine mechanism contributing to angiogenesis [J].J Cell Biol,1998,14l:1659-1673.

The Application of VEGF and bFGF Via Low-Frequency Ultrasound-Mediated Transdermal Drug Transport System in the Improvement of Maximizing Survival of Fascio-Cutaneous flap with Super Length Ratio in Pigs

LU Chuan,TAO Ran,ZHANG Jingde,SONG Jianxing,WANG Xiaoyun,YANG Chao.Corresponding author:YANG Chao. Department of Plastic Surgery,Changhai Hospital Affiliated the Second Military Medical University,Shanghai 200433,China.

PurposeTo explore the effects of single or combined application of VEGF and bFGF via the noninvasive medication of ultrasound-mediated transdermal drug transport(UMTDT)in the survival rate and microcirculation of fasciocutaneous flap with big ratio of length to width.MethodsA total of 100 fascio-cutaneous flaps were performed on the sides of the back in ten pigs.The flap area ranged from 3 cm×15 cm.These flaps were randomly divided into 5 groups as follows. A:control group with blank ultrasound;B:VEGF by low-frequency UMTDT;C:bFGF by low-frequency UMTDT;D:VEGF and bFGF by localized injection in multiple points;E:VEGF and bFGF by low-frequency UMTDT.The quantitative analysis of the vitality of the flaps,capillary intensity and expression index were observed 10 days after operation.ResultsThere was significant difference between the group of combined medication of both and bFGF via UMTDT and the other four groups in flap survival rate,capillary intensity and expression index.ConclusionThe combined medication of VEGF and bFGF via UMTDT can significantly enhance the survival rate of fascio-cutaneous flaps with big ratio of length to width.

Vascular endothelial growth factor(VEGF);Basic fibroblast growth factor(bFGF);Low-frequency ultrasound; Transdermal drug delivery;Super long flap;Fascio-cutaneous flap

R622+.9

A

1673－0364（2010）01－0021－03

2009年12月29日；

2010年1月19日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.01.006

200433上海市上海第二軍醫大學附屬長海醫院整形外科。

楊超。