SVF-PLGA聯(lián)合脂肪移植體內(nèi)構(gòu)建組織工程化軟組織充填材料的初步研究

麥凱欣 朱 輝 崔永言

SVF-PLGA聯(lián)合脂肪移植體內(nèi)構(gòu)建組織工程化軟組織充填材料的初步研究

麥凱欣 朱 輝 崔永言

目的采用組織工程方法，探討生物可降解材料、自體脂肪作為細(xì)胞外基質(zhì)，脂肪組織基質(zhì)血管成分（SVF）作為種子細(xì)胞構(gòu)建復(fù)合移植物，即刻回植，體內(nèi)培養(yǎng)并用于軟組織充填的可行性及安全性。方法取雄性新西蘭大白兔40只，隨機(jī)分為4組：實(shí)驗(yàn)組A、B（各10只）以兩種混合方式構(gòu)建SVF-脂肪-PLGA復(fù)合移植物，實(shí)驗(yàn)組A將SVF先與脂肪混合再種植于支架上，實(shí)驗(yàn)組B將SVF與支架充分混合，再用脂肪組織包埋；對(duì)照組A（n=10）的移植物為預(yù)處理后的空白支架；對(duì)照組B（n=10）的移植物為SVF-PLGA復(fù)合物。各組均將植入物移植至實(shí)驗(yàn)兔背部皮下與肌肉淺筋膜之間，于術(shù)后2個(gè)月、4個(gè)月取材，進(jìn)行大體觀察、組織切片、HE染色和油紅染色，了解支架降解情況和組織工程化軟組織充填材料構(gòu)建情況，觀察期間記錄術(shù)后所出現(xiàn)的各種并發(fā)癥和不良反應(yīng)。結(jié)果術(shù)后4個(gè)月時(shí)，各組均未發(fā)生切口感染、硬結(jié)形成、移植物移位和排斥等并發(fā)癥。實(shí)驗(yàn)組B中有1例切口裂開、2例脂肪液化。大體觀察和HE染色、油紅染色可見形成的組織工程化軟組織填充材料主要成分為血管化脂肪組織，未發(fā)現(xiàn)腫瘤樣細(xì)胞，外周形成纖維膜。4個(gè)月后PLGA支架完全降解，實(shí)驗(yàn)組B的脂肪存活率較實(shí)驗(yàn)組A和對(duì)照組B高。結(jié)論構(gòu)建SVF-脂肪-PLGA復(fù)合物軟組織充填材料是可行的，具有安全、可操作性強(qiáng)、耗時(shí)少、脂肪存活率高、塑形性好等優(yōu)點(diǎn)。

移植軟組織充填材料組織工程支架脂肪

軟組織充填已廣泛應(yīng)用于整形外科，可改善身體各部位，特別是面部脂肪缺損、塌陷及雙側(cè)不對(duì)稱等，尋找組織相容性好、易塑形、來源豐富的軟組織充填材料具有重要意義。自體充填材料存在取材有限、增加創(chuàng)傷等不足；異體及異種組織因移植后存在免疫排斥反應(yīng)，應(yīng)用較少。目前，雖已有不少人工合成材料，卻因組織相容性等問題而無法廣泛應(yīng)用，需要進(jìn)一步研制、開發(fā)新產(chǎn)品以適應(yīng)臨床需求[1]。本課題擬采用組織工程技術(shù)，探討生物可降解材料、自體脂肪復(fù)合細(xì)胞外基質(zhì)與SVF復(fù)合物即刻回植，體內(nèi)培養(yǎng)并進(jìn)行軟組織充填的可行性、安全性。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

Ⅰ型膠原蛋白酶（美國Sigma公司），高糖DMEM培養(yǎng)液（美國GIBCO公司），5%小牛血清（美國GIBCO公司），PLGA支架（韓國REGEN生物技術(shù)公司），蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），MPS 30倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司），CM 1900低溫恒冷冰凍切片機(jī)（德國Leica公司）。

1.2 動(dòng)物與分組

選用新西蘭雄兔（2～3月齡，南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）40只，體重2～2.5 kg，標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組A、B（各10只）以兩種混合方式構(gòu)建SVF-脂肪-PLGA復(fù)合移植物，實(shí)驗(yàn)組A將SVF先與脂肪混合再種植于支架上，實(shí)驗(yàn)組B將SVF與支架充分混合，再用脂肪組織包埋；對(duì)照組A（n=10）的移植物為預(yù)處理后的空白支架；對(duì)照組B（n=10）的移植物為SVF-PLGA復(fù)合物。每只實(shí)驗(yàn)兔回植2個(gè)相同移植物。

1.3 復(fù)合物構(gòu)建

1.3.1 SVF的提取

20%氨基甲酸乙酯溶液靜脈麻醉（5 mL/kg），于實(shí)驗(yàn)兔雙側(cè)腹股溝區(qū)取皮下脂肪，共約20 mL（每側(cè)約10 mL）。將脂肪組織剪成直徑約5 mm的碎塊，700 g離心3 min，0.1%膠原蛋白酶消化30 min，800 g離心10 min，取出成熟脂肪及纖維組織上懸液和上清液后加入緩沖液輕柔震蕩，移去上清液，加入小牛血清2 mL，吹打重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.2 PLGA支架的預(yù)處理

無菌操作下從產(chǎn)品原容器中取出支架，用無菌剪刀將其修剪成若干小塊（1.5 cm×2 cm×0.3 cm），50%乙醇浸泡，負(fù)壓抽吸至排盡空氣，低溫保存過夜后，無菌水浸泡清洗3次，抽吸至排盡空氣，PBS沖洗支架2次，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 移植物的構(gòu)建

SVF-脂肪-PLGA支架復(fù)合物：每10 mL脂肪組織中的5 mL用于提取SVF，另5 mL與PLGA和SVF混合構(gòu)建移植復(fù)合物。實(shí)驗(yàn)組A將SVF先與脂肪混合再種植于支架上；實(shí)驗(yàn)組B將SVF種植于支架上，再用脂肪組織包埋。

SVF-PLGA支架復(fù)合物：10 mL脂肪全部用于提取SVF，并將SVF均勻種植于支架上。

1.4 手術(shù)方法

20%氨基甲酸乙酯溶液靜脈麻醉（5 mL/kg），實(shí)驗(yàn)兔俯臥位，兔背部備皮，消毒、鋪巾。取背部垂直脊柱的長約1.5 cm的切口，鈍性分離皮下組織與肌肉淺筋膜間的潛在間隙（約3 cm×2 cm×0.3 cm），將已制備好的復(fù)合物置入，3-0絲線全層縫合切口，留置切口標(biāo)記線。

1.5 觀察指標(biāo)

復(fù)合物植入前的SVF細(xì)胞計(jì)數(shù)，術(shù)后2個(gè)月、4個(gè)月分別對(duì)每只實(shí)驗(yàn)兔取1個(gè)移植物標(biāo)本，行大體觀察、體積測量，并計(jì)算復(fù)合物存活率，快速冰凍切片后HE染色和油紅染色，鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 1.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；實(shí)驗(yàn)分組間的移植物體積比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 充填移植物植入前的SVF細(xì)胞計(jì)數(shù)及移植物在術(shù)前、術(shù)后2個(gè)月和術(shù)后4個(gè)月的體積

因部分移植物形狀不規(guī)則，全部均以排液量（磷酸鹽緩沖液）作為體積計(jì)量記錄。實(shí)驗(yàn)組A、B和對(duì)照組B的移植物植入前SVF細(xì)胞計(jì)數(shù)無顯著性差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)組A、B的移植物在術(shù)前的體積無顯著性差異（P＞0.05），術(shù)后2個(gè)月、4個(gè)月實(shí)驗(yàn)組B的移植物體積均比實(shí)驗(yàn)組A大，有顯著性差異（P＜0.05），其體積變化的標(biāo)準(zhǔn)差也比實(shí)驗(yàn)組A小。實(shí)驗(yàn)組A、B的移植物存活率平均值較對(duì)照組B高（表1）

表1 SVF細(xì)胞計(jì)數(shù)、移植物手術(shù)前后體積變化和存活率比較

2.2 大體觀察

術(shù)后2個(gè)月：實(shí)驗(yàn)組可見乳白色半透明脂肪組織內(nèi)有殘留PLGA支架，質(zhì)地柔軟，20個(gè)取出標(biāo)本的平均體積較植入前小；A、B兩組外觀基本相同，只存在體積差異。對(duì)照組A的殘留PLGA支架較實(shí)驗(yàn)組的殘留PLGA支架稍大，外周包繞完整纖維膜，質(zhì)硬如軟骨。對(duì)照組B可見鮮紅色類圓形團(tuán)塊狀物，外周有較致密纖維膜包裹，質(zhì)韌，切開見殘留PLGA支架。

術(shù)后4個(gè)月：實(shí)驗(yàn)組可見乳白色不透明脂肪組織，質(zhì)地柔軟，切開未見殘留PLGA支架。A、B兩組外觀基本相同，20個(gè)取出標(biāo)本的平均總體積與植入前基本一致，B組的平均體積稍大，但2個(gè)標(biāo)本發(fā)生完全或部分脂肪液化。對(duì)照組A的PLGA支架已完全降解，剖開移植物未見支架成分殘留，原植入?yún)^(qū)可見少許纖維樣組織，與皮下組織緊密粘連。對(duì)照組B可見類矩形片狀脂肪組織，外周有纖維組織膜狀增生，質(zhì)較柔軟（圖1）。

圖1 術(shù)后4個(gè)月，各組大體觀察

對(duì)照組A、B和實(shí)驗(yàn)組A均未發(fā)生術(shù)后切口裂開、感染和硬結(jié)形成、移植物移位等并發(fā)癥。實(shí)驗(yàn)組B中有1例發(fā)生移植區(qū)傷口裂開，再次予以縫合；1例發(fā)生移植區(qū)完全脂肪液化；1例發(fā)生移植物部分脂肪液化。

圖2 術(shù)后2個(gè)月，實(shí)驗(yàn)組組織學(xué)觀察（100×）

圖3 術(shù)后2個(gè)月，對(duì)照組B組織學(xué)觀察（100×）

2.3 組織學(xué)觀察

術(shù)后2個(gè)月：實(shí)驗(yàn)組快速冰凍切片HE染色可見PLGA支架殘留量較大，外周有薄層纖維膜狀增生，脂肪細(xì)胞主要分布于殘留支架外周，脂肪細(xì)胞內(nèi)含大脂滴，脂滴外周為薄層胞質(zhì)，核被推擠到一側(cè)，多聚成群；脂肪組織內(nèi)可見少許毛細(xì)血管長入。油紅染色可見支架外脂肪細(xì)胞橙紅染色。實(shí)驗(yàn)組A、B的鏡下觀察未見差異（圖2）。對(duì)照組A可見降解中的不規(guī)則網(wǎng)狀支架，其內(nèi)可見少許毛細(xì)血管長入，外周有薄層纖維膜狀增生，未見脂肪細(xì)胞，油紅染色未見橙紅色細(xì)胞層。對(duì)照組B亦可見中央的不規(guī)則網(wǎng)狀支架，脂肪組織在支架空隙生長，以支架外1/2較明顯，油紅染色呈多個(gè)橙紅色脂肪細(xì)胞層（圖3）。

術(shù)后4個(gè)月：實(shí)驗(yàn)組快速冰凍切片HE染色可見致密的脂肪細(xì)胞層，脂滴較術(shù)后2個(gè)月的大，內(nèi)未見PLGA支架殘留，脂肪組織間可見不規(guī)則纖維隔，外周未見明顯纖維膜狀增生；脂肪組織內(nèi)可見毛細(xì)血管長入，管壁細(xì)胞層較前增多。油紅染色可見脂肪細(xì)胞橙紅染色。實(shí)驗(yàn)組A、B的鏡下觀察未見差異（圖4）。對(duì)照組A可見致密纖維組織，內(nèi)有淋巴細(xì)胞浸潤，少許毛細(xì)血管長入，油紅染色未見橙紅色細(xì)胞層（圖5）。對(duì)照組B原有的網(wǎng)狀支架基本消失并被脂肪組織取代，油紅染色呈多個(gè)橙紅色脂肪細(xì)胞層。

圖4 術(shù)后4個(gè)月，實(shí)驗(yàn)組組織學(xué)觀察（100×）

圖5 術(shù)后4個(gè)月，對(duì)照組A組織學(xué)觀察（100×）

討論

軟組織充填的材料分注射性和非注射性兩類，前者是指注射到皮膚或皮下組織內(nèi)，達(dá)到矯正缺陷的目的，因其操作簡便，來源豐富，所以占有軟組織充填材料的絕大部分，但有時(shí)會(huì)出現(xiàn)全身及局部損害，如注射物移位、水腫、肉芽腫樣反應(yīng)、細(xì)胞毒性、遺傳毒性等[2]。因此，非注射性材料，如無細(xì)胞真皮基質(zhì)（Alloderm）、人發(fā)制備軟組織充填材料、生物可降解支架等[3－5]被嘗試用于臨床。

在注射性軟組織充填材料中，脂肪移植一直備受關(guān)注，尤其是抽脂術(shù)在臨床廣泛應(yīng)用后，自體脂肪顆粒移植被越來越多的醫(yī)生和患者所接受，并在獲取、純化、注射脂肪和提高其生存率等方面不斷得到提高。SVF是含有大量多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞，取材方便，增殖能力強(qiáng)[6]，其富含的脂肪組織來源干細(xì)胞（ASCs），具有以下幾個(gè)特點(diǎn)[7]：①具備分化為脂肪細(xì)胞的潛能，并且促進(jìn)細(xì)胞更新?lián)Q代；②可分泌SDF-1、HGF等血管生長因子，并使自身分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)受區(qū)組織在損傷、缺氧的刺激下血管化；③ASCs在分化的同時(shí)，數(shù)目基本不變，增殖分化功能得以維持。此外，提取SVF能省卻提取ASCs的體外擴(kuò)增步驟，簡化了實(shí)驗(yàn)過程，并節(jié)省了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，所以選取SVF作為種子細(xì)胞是可行的，并具有耗時(shí)少的優(yōu)勢。

選擇合適的細(xì)胞載體作為細(xì)胞外基質(zhì)是使SVF中的ASCs得以增殖、分化的重要條件[8]。脂肪組織本身含有較豐富的膠原、纖維粘連蛋白、蛋白聚糖等，可提供良好的細(xì)胞外基質(zhì)。近年提出的細(xì)胞輔助脂肪轉(zhuǎn)移（Cell-Assisted Lipotransfer，CAL）技術(shù)[9]，同時(shí)解決了移植脂肪中ASCs含量低和移植SVF缺乏細(xì)胞外基質(zhì)兩個(gè)問題，并簡化了SVF提取的體外培養(yǎng)、多次離心重懸等步驟，但CAL技術(shù)提高移植脂肪存活率的具體數(shù)據(jù)并沒有準(zhǔn)確報(bào)道，且塑形性較差，充填效果僅在臨床體現(xiàn)，未有組織學(xué)證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)選用的支架為PLGA，具備生物可降解性，其降解產(chǎn)物為H2O和CO2，組織相容性好，網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)使干細(xì)胞分布均勻，有利其生長，可作為良好的細(xì)胞外基質(zhì)。Choi等[10]以裸鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，提出了ASCs復(fù)合PLGA用于軟組織充填的可能性，但是該方法需要7～10 d體外擴(kuò)增時(shí)間才能取得足夠量的ASCs，使臨床應(yīng)用受到限制。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)中的對(duì)照組B的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)，直接以SVF作為種子細(xì)胞，簡化了ASCs的提取步驟，但單純使用SVF、支架復(fù)合培養(yǎng)在手術(shù)后初期存在充填局部僵硬，手感差，且脂肪存活率低等缺點(diǎn)。若將脂肪組織和可降解材料兩者結(jié)合，作為含有生物組織和組織工程材料的復(fù)合細(xì)胞外基質(zhì)，構(gòu)建SVF-脂肪-PLGA充填移植物，不僅能保證有效的ASCs濃度，亦能為其提供膠原蛋白含量豐富、有利于ASCs爬行生長和組織相容性好的細(xì)胞外基質(zhì)，有望互補(bǔ)不足，從而優(yōu)化軟組織充填效果。單純脂肪移植、CAL的平均存活率大約為40%～80%[7]，實(shí)驗(yàn)組A、B的存活率均在90%以上，大大提高了移植脂肪的存活率。

實(shí)驗(yàn)組A與實(shí)驗(yàn)組B的移植物存活率和并發(fā)癥發(fā)生情況存在差異，提示SVF與支架充分混合后再用脂肪組織包埋的移植物存活率較高，即以PLGA支架作為主要的細(xì)胞載體，脂肪作為SVF提供營養(yǎng)的生物物質(zhì)，對(duì)ACSs的存活、增殖和分化是有利的。我們認(rèn)為，用脂肪組織來包埋SVF-PLGA復(fù)合物，能為種子細(xì)胞SVF創(chuàng)造一個(gè)相對(duì)封閉的、營養(yǎng)充分的生存內(nèi)環(huán)境，從而減少了移植區(qū)局部環(huán)境對(duì)移植物的影響；存在于SVF的ASCs本身具有分泌血管生長因子的作用，脂肪組織亦為血管化提供良好的條件，提高了ASCs的生命力和脂肪的存活率。要進(jìn)一步優(yōu)化生長內(nèi)環(huán)境，可考慮添加合適的細(xì)胞因子或其他營養(yǎng)物質(zhì)等，有待于進(jìn)一步探索。另外，脂肪液化的發(fā)生，可能是因?yàn)槭中g(shù)時(shí)分離腔隙狹窄、脂肪組織與切口接觸緊密等因素。

實(shí)驗(yàn)中，4組均有充填移植物的外周纖維膜形成。可能是因?yàn)橐浦参锖Ъ芡鈦沓煞郑瑱C(jī)體產(chǎn)生異物反應(yīng)；實(shí)驗(yàn)兔手術(shù)應(yīng)激性反應(yīng)較大，導(dǎo)致發(fā)生無菌性炎癥；存活后的移植脂肪組織的旁分泌作用誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞趨化，促進(jìn)了纖維膜形成[11]。

軟組織充填除了用于面部充填外，也應(yīng)用于陰莖增粗[12－13]。陰莖增粗主要依賴于軟組織充填的各種手段來實(shí)現(xiàn)，多種軟組織充填材料包括自體組織移植和皮瓣轉(zhuǎn)移、各種人工合成假體已應(yīng)用于陰莖增粗。但由于陰莖的特殊結(jié)構(gòu)、形態(tài)及因勃起而出現(xiàn)的體積變化等，使其對(duì)充填材料的要求更高，安全有效的陰莖增粗充填材料仍在研究中[14-22]。組織工程技術(shù)用于重建陰莖結(jié)構(gòu)與功能是近年來重建外科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[23]。Perovic等[22]利用成纖維細(xì)胞體外擴(kuò)增后復(fù)合可降解支架體內(nèi)回植，使陰莖增粗獲得成功，這是首次利用PLGA為支架的細(xì)胞自體移植用于軟組織充填的臨床應(yīng)用，但體外擴(kuò)增需要時(shí)間較長，手術(shù)時(shí)機(jī)難以把握。吳意光等[24]從病理學(xué)角度證明了自體成纖維細(xì)胞種植PLGA支架的安全性，認(rèn)為是安全有效的組織工程細(xì)胞支架復(fù)合物。本實(shí)驗(yàn)嘗試?yán)肧VF提取簡便的優(yōu)勢，省卻了體外擴(kuò)增的步驟，能縮短治療時(shí)間；同時(shí)構(gòu)建SVF-脂肪-PLGA復(fù)合充填材料，有效提高了移植脂肪的存活率，改善了單純SVF-PLGA移植在手術(shù)后初期充填局部僵硬、手感差、遠(yuǎn)期存活率低等缺點(diǎn)，為臨床應(yīng)用提供了理論和實(shí)踐依據(jù)。

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Preliminary Study of Co-Transplantation of SVF-PLGA with Fat Complex on the Construction of Tissue Engineering Implant

MAI Kaixin,ZHU Hui,CUI Yongyan.Department of Plastic Surgery,Peking University Shenzhen Hospital,Shenzhen 518036,China.Corresponding author:ZHU Hui.

ObjectiveTo evaluate the feasibility and safety of co-transplantation of SVF-PLGA with fat complex on the construction of tissue engineered implant.MethodsForty adult New Zealand male rabbits were randomly divided into four groups.In the experimental group A(n=10),implant was constructed by use of SVF-PLGA with fat complex and in the group B (n=10).SVF-PLGA complex buried by adipose tissue was used.In the control group C(n=10)only PLGA and group D(n=10), SVF-PLGA complex was used.All the complex were translated between skin and superficial fascia.Tissue samples obtained were analyzed with gross observation,HE stain and red oil stain at 4 months postoperatively.ResultsThe tissue engineered implant was mainly vascularized adipose tissue without tumor cell.PLGA scaffolds were degraded completely 4 months later. The survival rate of fat in experimental group B was higher than in the group A and in the control group B.Conclusion SVF-PLGA with fat complex on soft tissue with the advantage of high survival rate of fat.

Transplantation;Soft tissue;Implant;Tissue engineer;Scaffold;Fat

Q813.1+2

A

1673－0364（2010）01－0009－05

2009年11月22日；

2010年1月24日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.01.003

518036廣東省深圳市北京大學(xué)深圳醫(yī)院整形美容外科（麥凱欣，朱輝，崔永言）；515031廣東省汕頭市汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院（麥凱欣）。

朱輝。