富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白在病理性瘢痕中的表達(dá)及其意義

劉超華 李小靜 寧金龍 王 春

富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白在病理性瘢痕中的表達(dá)及其意義

劉超華 李小靜 寧金龍 王 春

目的觀察富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白（Secreted protein,acidic and rich in cysteine，SPARC）在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕中的表達(dá)規(guī)律及其意義。方法瘢痕患者的瘢痕疙瘩和3～12個(gè)月增生性瘢痕組織各26例；另取手術(shù)剩余的正常成人皮膚組織5例；所有標(biāo)本用40 g/L甲醛固定，行連續(xù)切片，厚4 μm，應(yīng)用鏈菌素生物素-過(guò)氧化物酶標(biāo)記物免疫組織染色法染色。同時(shí)設(shè)正常對(duì)照（正常皮膚）、陽(yáng)性對(duì)照（胃癌癌變組織）、陰性對(duì)照（磷酸鹽緩沖液代替一抗）。鼠抗人SPARC單克隆一抗?jié)舛葹?∶200。結(jié)果正常成人皮膚中SPARC表達(dá)稀少，局限在真皮-表皮交界的乳頭真皮，部分靠近基底膜血管和皮膚附件。SPARC在增生性瘢痕的真皮瘢痕組織、皮膚附件中低表達(dá)，且早期增生性瘢痕中表達(dá)無(wú)明顯強(qiáng)于晚期增生性瘢痕（P＞0.05）。在真皮中SPARC呈彌散性散在分布（同增生性瘢痕），陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)較低。增生性瘢痕及瘢痕疙瘩的SPARC較正常皮膚表達(dá)無(wú)差異（P＞0.05）。結(jié)論SPARC在3～12個(gè)月增生性瘢痕中呈低表達(dá)，在瘢痕疙瘩中低表達(dá)。

瘢痕疙瘩富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白增生性瘢痕表達(dá)

病理性瘢痕包括增生性瘢痕（Hypertrophic scar，HS）和瘢痕疙瘩（Keloid），是人體創(chuàng)傷、炎癥、燒傷或自發(fā)的一種過(guò)度的皮膚纖維增生性疾病。其組織學(xué)特點(diǎn)為大量成纖維細(xì)胞增生，細(xì)胞外基質(zhì)中膠原、蛋白多糖、糖蛋白等過(guò)度沉積，膠原纖維排列紊亂。富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白（Secreted protein,acidic and rich in cysteine，SPARC），是一種與基質(zhì)相聯(lián)系的糖蛋白，屬于細(xì)胞母蛋白家族[1]?，F(xiàn)有研究證明，其在多種纖維化疾?。ㄈ绶卫w維化[2]、肝纖維化[3]、腎纖維化[4]及心肌纖維化[5]）過(guò)程中起重要作用，并參與系統(tǒng)性硬化癥的發(fā)生[6]及創(chuàng)傷愈合的過(guò)程[7]。此外，SPARC在幾種惡性腫瘤中亦有過(guò)度表達(dá)[10]，如乳癌、食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、黑色素瘤等，并且其表達(dá)增高的程度與浸潤(rùn)能力成正比。因其在創(chuàng)傷愈合、纖維化疾病、瘢痕和腫瘤形成中起重要作用，SPARC正逐漸引起人們的廣泛關(guān)注。

我們以免疫組化技術(shù)對(duì)SPARC在病理性瘢痕和正常皮膚組織中的表達(dá)進(jìn)行觀察，旨在研究發(fā)現(xiàn)其中的差異，以揭示SPARC在瘢痕形成機(jī)制中的可能作用，以期更好地認(rèn)識(shí)病理性瘢痕的發(fā)生機(jī)制，為預(yù)防和治療病理性瘢痕提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)本取自我院患者。其中增生性瘢痕26例（按損傷后3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月、12個(gè)月不同時(shí)間分組編號(hào)），其中男16例、女10例，年齡4～66歲，標(biāo)本分別取自面部、頸部、胸部、肩部及四肢；瘢痕疙瘩26例，其中男11例、女15例，年齡12～55歲，標(biāo)本分別取白面部、頸部、胸部、肩部及四肢；正常皮膚5例，其中男4例、女l例，年齡3～65歲，標(biāo)本分別取自面部、頸部、胸部、肩部及四肢。各組年齡、性別差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。瘢痕組織取材前，患者均未經(jīng)任何藥物治療，且取材部位無(wú)破潰、感染、腫瘤等其他疾病[8]。

1.2 試劑及儀器

一抗（Santa cruz公司，美國(guó)）；二抗及SP試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；PBS緩沖液（北京中山金橋技術(shù)有限公司）；枸櫞酸鹽緩沖液（武漢博士德生物工程有限公司）；多聚賴氨酸（北京中山金橋技術(shù)有限公司）；倒置相差顯微鏡（奧林巴斯映像銷售有限公司）；數(shù)顯電恒溫水槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司）；恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司）；分析天平（上海精科天平廠）；移液器（Eppendorf公司，德國(guó)）；切片機(jī)（上海一恒科技公司）；低溫冰箱（三洋制冷設(shè)備公司，日本）；純水機(jī)（Labconco公司，美國(guó)）；恒溫干燥箱（上海一恒科技公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色法

主要步驟包括：①多聚賴氨酸抗脫片處理。②切片用二甲苯脫脂，梯度乙醇和蒸餾水水化。③體積分?jǐn)?shù)為0.03的過(guò)氧化氫室溫5～10 min，封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，蒸餾水洗3次。④滴加正常血清封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，不洗。⑤滴加適當(dāng)稀釋的鼠抗人SPARC一抗（1∶200）50 mL，37℃1 h孵育，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液洗2 min，3次。⑥滴加生物素羊抗鼠IgG，37℃，20 min，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液洗2 min，3次。⑦滴加試劑鏈菌素生物素一過(guò)氧化物酶標(biāo)記物37℃，20 min，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液洗5 min，4次。⑧室溫控制下二氨基聯(lián)苯胺顯色，顯色時(shí)間8 min，蒸餾水洗滌。⑨蘇木精輕度復(fù)染，脫水、透明、封固，鏡下觀察。

1.3.2 綜合染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí)

SP法染色后鏡下觀察。取表達(dá)最強(qiáng)的部位，按著色程度評(píng)分：基本未著色、染色與背景相似者為0分；著色淺、略高于背景者為1分；中度著色、明顯高于背景者為2分；深度著色者為3分。按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)少于25%為0分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)達(dá)25%～49%為1分；50%～75%為2分；超過(guò)75%為3分。兩項(xiàng)相加后，0～1分為（-），2分為（+），3～4分為（++），5分以上為（+++）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件。用X2檢驗(yàn)和方差分析處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

SPARC在正常皮膚表皮中呈陰性表達(dá)；在真皮內(nèi)分布于真皮-表皮交界的乳頭真皮處，呈少量、不連續(xù)、斑點(diǎn)樣表達(dá)（圖1）。

在增生性瘢痕表皮中SPARC表達(dá)均呈陰性；在增生性瘢痕真皮組織中SPARC呈散在分布，主要見于成纖維細(xì)胞、膠原纖維、平滑肌細(xì)胞、皮膚附件、浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞（圖2）。增生性瘢痕真皮中，SPARC的表達(dá)與正常皮膚組無(wú)明顯差異（P＞0.05）（表1）。增生性瘢痕組中，損傷后3～6個(gè)月與9～12個(gè)月的標(biāo)本無(wú)明顯差異（表2）。

SPARC在瘢痕疙瘩表皮中呈陰性表達(dá)；在真皮中，SPARC同在增生性瘢痕一樣呈彌散性散在分布，陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)較低（圖3），其表達(dá)強(qiáng)度略高于正常皮膚組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。增生性瘢痕與瘢痕疙瘩的差別亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

圖1 SPARC在正常皮膚中的表達(dá)（400×）

圖2 SPARC在增生性瘢痕中的表達(dá)（400×）

圖3 SPARC在增生性瘢痕疙瘩中的表達(dá)（400×）

表1 SPARC在不同組織真皮中的表達(dá)情況

表2 SPARC在增生性瘢痕不同時(shí)期的表達(dá)情況

3 討論

SPARC廣泛存在于人體組織中，最初是作為非膠原成分被描述和純化的[9]。隨后的研究表明，SPARC在人體中分布廣泛，尤其是在發(fā)育和重建中的組織。體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)表明，它能影響多種細(xì)胞的活動(dòng)，SPARC及其相關(guān)的肽與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合，影響細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)，改變細(xì)胞形態(tài)變化，降低細(xì)胞的黏附性，影響細(xì)胞的遷移，調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖及血管發(fā)生[1，10]。這些功能同器官纖維化、創(chuàng)傷愈合、腫瘤以及皮膚纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10-11]。

在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，SPARC能在浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，我們推測(cè)外傷、炎癥刺激可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)SPARC，表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞上的SPARC參與淋巴細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞間的相互作用，增強(qiáng)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附，從而促進(jìn)炎癥的發(fā)生與發(fā)展。SPARC在病理性瘢痕組織中的低表達(dá)，提示血管內(nèi)皮細(xì)胞處于激活狀態(tài)，病理性瘢痕組織中有持續(xù)的炎癥反應(yīng)存在，這種持續(xù)的炎癥反應(yīng)可能和組織的過(guò)度修復(fù)、瘢痕增生有關(guān)。

SPARC能影響細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)，Thomas等[12]使用博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠動(dòng)物模型來(lái)闡述SPARC同膠原蛋白之間的關(guān)系及SPARC調(diào)控肺纖維化的發(fā)展，結(jié)果表明無(wú)SPARC的小鼠Ⅰ型膠原蛋白含量明顯低于野生型小鼠，并進(jìn)一步指出肺損傷后SPARC和Ⅰ型膠原蛋白同時(shí)增加。SPARC在創(chuàng)傷愈合膠原纖維產(chǎn)生中起重要作用，能通過(guò)調(diào)控Ⅰ型前膠原以調(diào)節(jié)SPARC與細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)系，進(jìn)而改變創(chuàng)傷的愈合[13-15]。我們推測(cè)，在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩纖維化進(jìn)程中，SPARC進(jìn)行高水平轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而翻譯成蛋白質(zhì)，后者刺激組織中成纖維細(xì)胞的增殖和以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，增殖的成纖維細(xì)胞又會(huì)產(chǎn)生更多的SPARC，如此反復(fù)循環(huán)，最終形成大量的纖維化組織，導(dǎo)致瘢痕增生；SPARC也可能通過(guò)各種細(xì)胞因子及蛋白酶相互作用來(lái)促進(jìn)膠原蛋白的生成如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）及熱休克蛋白47等[16]。本實(shí)驗(yàn)提示，在增生性瘢痕真皮組織中SPARC呈彌散分布，陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)較低；在瘢痕疙瘩真皮中SPARC呈彌散性散在分布，陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)較低。這與瘢痕組織真皮層成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積的主要病理改變不相吻合。因此，SPARC在病理性瘢痕的發(fā)病機(jī)制中起的作用及作用過(guò)程，需要通過(guò)對(duì)病理性瘢痕、正常皮膚來(lái)源的成纖維細(xì)胞進(jìn)行離體培養(yǎng)，檢測(cè)其SPARC分子水平表達(dá)的差異情況，來(lái)進(jìn)一步進(jìn)行深入研究。

[1]Phan E,Ahluwalia A,Tranawski AS.Role of SPARC-matricellular protein in pathophysiology and tissue injury healing.implications for gastritis and gastric ulcers[J].Med Sci Monit,2007,13(2):25-30.

[2]Thomas HB,Gretchen B,Marina C,et al.SPARC regulates extracellular matrix organization through Its modulation of integrinlinked kinase activity[J].J Biological Chemistry,2005,280(43): 36483-36493.

[3]Kazuki N,Shuichi S,Norifumi K,et al.Expression of SPARC byactivated hepatic stellate cells and its correlation with the stages of fibrogenesis in human chronic hepatitis[J].Virchows Arch, 2002,441(5):466-474.

[4]Taneda S,Pippin JW,Sage EH,et al.Amelioration of diabetic nephropathy in SPARC-null mice[J].J Am Soc Nephrol,2003,14 (4):968-980.

[5]Amy DB,Catalin FB,Tyler JR,et al.Role of SPARC in postsynthetic collagen processing in the aging myocardium[J].J Cardiac Failure,2007,13(1):114-123.

[6]Zhou X,Tan FK,Guo XJ,et al.Attenuation of collagen production with small interfering RNA of SPARC in cultured fibroblasts from the skin of patients with scleroderma[J].Arthritis&Rheumatism, 2006,54(8):2626-2631.

[7]Amy DB,May JR,Helene S.SPARC-null mice exhibit accelerated cutaneous wound closure[J].J Histochem&Cytochem,2002,50(1): 1-10.

[8]Berman B,Flores F.The treatment of hypertrophic scars and keloids [J].Eur J Dermatol,1998,8(4):591-595.

[9]Lane TF,Sage EH,1994.The biology of SPARC,a protein that modulates cell-matrix interactions[J].FASEB J,1994,8(2):163-173.

[10]Podhajcer OL,Benedetti LG,Girotti MR,et al.The role of the matricellular protein SPARC in the dynamic interaction between the tumor and the host[J].Cancer Metastasis Rev,2008,27(3): 523-537.

[11]Tai IT,Tang MJ.SPARC in cancer biology:its role in cancer progression and potential for therapy[J].Drug Resist Updat,2008, 11(6):231-246.

12Thomas PS,David KM,Daniel JW,et al.Collagen accumulation is decreased in SPARC-null mice with bleomycin-induced pulmonary fibrosis[J].Am J Physiol,1999,277(3):628-635.

[13]Wang H,Fertala A,Ratner BD,et al.Identifying the SPARC binding sites on collagen I and procollagen I by atomic force microscopy [J].Anal Chem,2005,77(21):6765-6771.

[14]Tyler JR,Felicitta P,Paul B,et al.SPARC regulates processing of procollagen I and collagen fibrillogenesis in dermal fibroblasts [J].J Biological Chemistry,2007,282(30):22062-22071.

[15]Giudici C,Raynal N,Wiedemann H,et al.Mapping of SPARC/ BM-40/osteonectin-binding sites on fibrillar collagens[J].J Biol Chem,2008,283(28):19551-19560.

[16]Martinek N,Shahab J,Sodek J,et al.Is SPARC an evolutionarily conserved collagen chaperone[J]?J Dent Res,2007,86(4):296-305.

The Expression and Significance of Secreted Protein,Acidic and Rich in Cysteine in Hypertrophic Scar and Keloid Tissue

LIU Chaohua,LI Xiaojing,NING Jinlong,WANG Chun.Department of Plastic Surgery,First Affiliated Hospital of Anhui Medical University,Hefei 230022,China.Corresponding author:LI Xiaojing.

ObjectiveTo investigate the expression and significance of Secreted protein,acidic and rich in cysteine (SPARC)in keloid and hypertrophic scar(HS).MethodsTissue samples were harvested from 26 patients with keloid and 26 with HS(3-12 months)and 5 from the skin of healthy adults.All specimens were fixed in 40 g/L formalin.Then the specimens were continuously sliced into 4 μm thick sections.These sections were stained by streptoavidin-biotion method of immunohisto-chemistry.The other groups were normal control(normal skin),positive control(gastric cancerous tissue)and negative control(phosphate buffer)instead of The first antibody.The concentration of Rat anti-human SPARC monoclonal antibody were 1∶200.ResultsThere was scarce expression of SPARC in the skin tissue of healthy adults,and it was only present in the dermal papillae at the dermis epider-mis conjunctions and partly in the blood vessels and skin appendages adjacent to the basement membrane.There was low expression of SPARC in the dermal scar tissue and skin appendages in HS.Also,early expression of hypertrophic scar sputum.There was no significantly difference in the expression between late hypertrophic scar(P＞0.05).SPARC showed scattered diffuse distribution as the same in the hypertrophic scar,and the lower expression of positive signals in the keloid.Compared with that in normal skin,there was no significant difference in the SPARC expression between HS and keloid(P＞0.05).ConclusionThere was lower SPARC expression in HS(3-12 months), and lower expression in keloid.

Keloid;Secreted protein,acidic and rich in cysteine(SPARC);Hyperplastic scar(HS);Expression

Q786

A

1673-0364（2010）01-0017-04

2010年1月8日；

2010年2月5日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.01.005

安徽省自然科學(xué)基金（070413102）。

230022安徽省合肥市安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科。

李小靜。