高效液相色譜法測定甜瓜蒂中葫蘆素B含量

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(陜西天遠藥業有限公司，陜西 西安 710072)

甜瓜蒂為葫蘆科一年生草質藤本植物甜瓜(CucumismeloL.)的果蒂，別名瓜蒂、苦丁香，始著錄于《神農本草經》，為上品之藥，系《中國藥典》一部1977年版收載品種，味苦，性寒，入胃經，可用于治療痰涎宿食、壅塞上脘、胸中痞鞭、風痰癲癇、濕熱黃疸、四肢浮腫、鼻塞、喉痹等。實踐證明甜瓜蒂治療頑固性黃疸療效顯著[1]。成分研究表明，甜瓜蒂主要含葫蘆素系化合物，包括葫蘆素B、葫蘆素E、葫蘆素D、異葫蘆素B、葫蘆素B葡萄糖苷等，還含有甾醇、皂苷及氨基酸[2]。葫蘆素系化合物中，葫蘆素B(Cucurbitacin B) 占80%以上，是抗肝炎、肝癌的有效單體，主要用于因濕熱毒盛所致遷延性肝炎、慢性肝炎及原發性肝癌的輔助治療[3]。雖然高效液相色譜(HPLC)已成為中藥原料和制劑質量控制的重要手段，但運用HPLC測定葫蘆素B的報道很少[4～6]，且尚未見用于甜瓜蒂中葫蘆素B的測定報道。作者采用高效液相色譜法測定葫蘆素B含量，方法簡便、快速、可靠、實用，可作為甜瓜蒂藥材的質量控制方法。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

甜瓜蒂藥材購自西安藥材批發市場。

葫蘆素B對照品(TLC檢查為單一斑點，歸一化法計算純度為99.13%)，百靈威化學技術有限公司；乙腈為色譜純，水為超純水，其它試劑為分析純。

L2000型高效液相色譜儀，紫外可見光檢測器；UV-1200型紫外可見分光光度計。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.05 mol·L-1K2HPO4(40∶60)；檢測波長：228 nm。在此條件下葫蘆素B峰與其它雜質峰R>1.5，理論板數按葫蘆素B峰計達3000以上。

1.2.2 對照品溶液的配制

精密稱取葫蘆素B對照品適量，置棕色瓶中，加乙腈制成100 μg·mL-1的溶液。

1.2.3 供試液的配制

取甜瓜蒂，粉碎，過100目篩，精密稱取適量置100 mL容量瓶中，加甲醇100 mL，浸泡過夜，超聲處理60 min，放冷，加甲醇定量，微孔濾膜過濾，取續濾液進樣測定。

1.2.4 標準曲線的繪制

稱取葫蘆素B對照品約25 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取1 mL、2 mL、5 mL、7.5 mL和10 mL，置10 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻。分別取20 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，以峰面積A對濃度c(μg·mL-1)繪制標準曲線，擬合線性回歸方程A= 4610.4c-1023，R=0.9994(n=5)，線性范圍25.2～252 μg·mL-1。

2 結果與討論

2.1 高效液相色譜圖(圖1)

圖1 葫蘆素B對照品(a)和甜瓜蒂藥材(b)的HPLC圖譜

2.2 穩定性實驗

取甜瓜蒂藥材，按1.2.3方法配制溶液，放置0 h、1 h、2 h、6 h、12 h分別進樣，各測定5次，結果葫蘆素B含量測定的RSD為1.34%。

2.3 重復性實驗

取甜瓜蒂藥材，按1.2.3方法配制溶液，測定其葫蘆素B含量，測定5次，其葫蘆素B平均含量為0.821%，RSD=1.68%。

2.4 回收率實驗

精密稱取已測定含量的樣品適量，加入定量的葫蘆素B對照品，按1.2.2和1.2.3方法配制溶液，測定葫蘆素B的含量，計算回收率，結果見表1。

表1 葫蘆素B的回收率

由表1可知，平均回收率為98.82%，RSD=1.75%。

2.5 樣品測定

取不同產地的甜瓜蒂，按上述方法操作，測定葫蘆素B的含量，結果見表2。

表2 不同產地甜瓜蒂藥材的葫蘆素B含量

由表2可知，6個不同產地藥材的葫蘆素B含量差別較大，總體來說，北方藥材的葫蘆素B含量高于南方藥材，可能與各地土壤、氣候、采收時間有關。

2.6 討論

(1)葫蘆素B分子結構中僅含α,β-不飽和酮的共軛結構(圖2)，β-位含一烷基取代基，其最大紫外吸收波長預計為(215+12)nm。紫外掃描測定結果顯示，其最大吸收波長為228 nm，符合經驗計算結果，也與文獻報道完全一致[4～6]。故檢測波長采用228 nm。

圖2 葫蘆素B的分子結構

(2)采用甲醇系統分析，發現測定重復性較差，這可能是由于甲醇在230 nm的吸光度約為0.15，本底吸收大，不同程度地影響到測定結果。改用乙腈-0.1 mol·L-1K2HPO4為流動相后，測定重復性大幅提高，符合定量要求。

3 結論

建立了高效液相色譜法測定甜瓜蒂藥材中葫蘆素B含量的方法。采用Hypersil C18色譜柱，以乙腈-0.05 mol·L-1K2HPO4(40∶60) 為流動相，波長228 nm下檢測。葫蘆素B濃度在25.2～252 μg·mL-1范圍內線性關系良好，平均回收率為98.82%。不同產地藥材的葫蘆素B含量相差很大。該法簡便快速、重現性好，可用于甜瓜蒂藥材中葫蘆素B含量的測定。

參考文獻：

[1] 賈建偉，楊積明，袁桂玉，等.甜瓜蒂經鼻粘膜給藥治療頑固性黃疸[J].天津醫藥，2004，32(6)：345-346.

[2] 江蘇新醫學院.中藥大詞典[M].上海：上海科學技術出版社，2004：756.

[3] WS3-B-3711-98，中華人民共和國衛生部藥品標準[S].

[4] 黃哲娃，張莉，李海生.RP-HPLC法測定葫蘆素滴丸中葫蘆素B的含量[J].中草藥，2003，34(5)：421-422.

[5] 黃璐琦，姚三桃.高效液相色譜法測定湖北栝樓根中葫蘆素B的含量[J].中國中藥雜志，1994，19(8)：490-491.

[6] 黃璐琦，姚三桃.高效液相色譜法測定異葉馬交兒根中葫蘆素B的含量[J].中草藥，1994，25(10)：555-557.