酶解法定量測定葡聚糖的研究

葡聚糖為白色的無定形粉末固體，無臭無味，易溶于水，不溶于酒精[1]。制糖過程中葡聚糖主要是腸膜明串珠菌分解的酶消耗蔗糖所生成的具有高粘性的物質[2]，當其含量達到一定程度時，其高粘性不僅造成甘蔗汁過濾、濃縮、結晶等后續操作困難，而且還造成糖分大量損失[3]。因此，定量分析制糖過程中葡聚糖含量至關重要。

目前國內外葡聚糖測定方法雖然很多，但缺點都比較明顯。如Roberts-銅法需反復洗滌、多次過濾，操作步驟過多，使得測定結果誤差大；Haze-酒精沉淀法操作復雜、對時間要求嚴苛、測得吸光度值過小等。因此，尋求一種操作簡單、準確度高、重復性好的萄聚糖定量測定方法勢在必行。

葡聚糖酶屬于葡聚糖水解酶系，可以專一地分解葡聚糖，將葡聚糖降解成水溶性的還原糖[4],因此，可以通過測定還原糖的量，來定量推算葡聚糖的含量。酶解法定量測定葡聚糖因所用葡聚糖酶具有高效專一性、重復穩定性好、樣品前處理簡便等特點，有望成為較有前景的葡聚糖定量測定方法。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

甘蔗汁由廣州甘蔗糖業研究所育種室提供；原糖由廣州甘蔗糖業研究所檢測中心提供。

醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(0.1 mol·L-1醋酸+0.1 mol·L-1醋酸鈉，pH=5.0)；其余試劑均為國產分析純。

UV-2102PC型紫外分光光度計，Unico公司；AL204型電子天平、Seven Multi型pH計，Mettler toledo公司；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋，上海宏精實驗設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

在標號為1#～10#的比色管中分別加入0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL、1.0 mL的1%的葡萄糖標準溶液,并補加蒸餾水至1 mL，其中0#比色管作為空白調零，然后依次加入2 mL DNS試劑，于沸水中煮沸5 min，迅速冷卻，用蒸餾水定容至25 mL， 30 min后于540 nm處測定OD值。以葡萄糖濃度為橫坐標、OD值為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.2 最適酶解時間的確定

用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液配制pH值為5(葡聚糖酶的最適酶解pH值)的濃度分別為1.0 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1T500葡聚糖標準溶液。各取0.5 mL標準溶液并加入0.5 mL酶活為200 U·mL-1的葡聚糖酶在55℃的水浴中分別反應不同時間后，迅速滅活，加入2 mL DNS試劑進行比色測定，同時做滅活樣對照。

1.2.3 回收率實驗

1.2.3.1 標準樣的回收率實驗

標準樣的回收率即葡聚糖酶在最適酶解時間內對葡聚糖的分解率。

分別用T40、T500、T2000的葡聚糖配制濃度為1.0 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1的標準溶液。各取0.5 mL標準溶液，加入0.5 mL 200 U·mL-1的葡聚糖酶在55℃的水浴中分別反應20 min、60 min、90 min、120 min, 迅速滅活，加入2 mL DNS試劑進行比色測定，同時做滅活樣對照。

1.2.3.2 試樣加標回收率實驗

取新鮮甘蔗汁，用Roberts-銅法[5]測定葡聚糖含量；再在酶解法的沉淀溶解液中加入5 mL 0.2 mg·mL-1T500葡聚糖標準溶液；最后用酶解法測定混合液的葡聚糖含量，計算回收率。

1.2.4 酶解法與Roberts-銅法的對比實驗

酶解法測定甘蔗汁中葡聚糖含量：取經過定性濾紙過濾的甘蔗汁5 mL，加入20 mL酒精，搖勻；在18 000 r·min-1、室溫條件下沉淀離心10 min；倒出上清液，取pH值為5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液5 mL，使離心沉淀溶解；取沉淀溶解液進行比色測定，同時做滅活樣對照。在不同時間段取樣測定比較。同時采用Roberts-銅法測定甘蔗汁中葡聚糖含量。對比兩方法結果。

1.2.5 酶解法與Haze-酒精沉淀法[6]的對比實驗

酶解法測定原糖中葡聚糖含量：稱取3.0 g原糖，溶解于100 mL蒸餾水中，取溶解液5 mL，加入20 mL酒精，搖勻，后續操作同1.2.4。同時采用Haze-酒精沉淀法測定原糖中葡聚糖含量。對比兩方法結果。

2 結果與討論

2.1 葡萄糖標準曲線的繪制(圖1)

圖1 葡萄糖標準曲線

由圖1可知，葡萄糖濃度與OD值在0.1～1.0 mg·mL-1濃度范圍內呈線性關系，擬合方程為y=0.8372x-0.0547，相關系數R2=0.9999。

2.2 最適酶解時間的確定

不同濃度T500葡聚糖酶解產物的還原糖含量與酶解時間的關系見圖2。

圖2 不同濃度葡聚糖標準溶液最適酶解時間

由圖2可知,最適酶解時間隨葡聚糖標準溶液濃度的不同而不同。葡聚糖酶對濃度為0.5 mg·mL-1、0.75 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1的T500葡聚糖標準溶液的最適酶解時間分別為20 min、60 min、90 min、120 min。

2.3 標準樣的回收率

葡聚糖酶酶解不同分子量葡聚糖的標準溶液，酶解產物的還原糖含量與萄聚糖濃度的關系見圖3。

圖3 不同分子量葡聚糖的標準溶液經酶解后產生的還原糖含量

由圖3可知,葡聚糖酶對不同分子量葡聚糖的分解率是相等的，分解率為56.0%。

2.4 試樣加標回收率(表1)

表1 甘蔗汁中葡聚糖的回收率測定

從表1可以看出，甘蔗汁中葡聚糖的回收率結果良好，回收率在(100±5)%之間，因而可以肯定葡聚糖酶對葡聚糖的分解是專一性的。

2.5 酶解法與Roberts-銅法、Haze-酒精沉淀法比較

將透光度OD值分別代入標準曲線y1=0.8372x1-0.0547(酶解法標準曲線)、y2=0.9576x2+0.0073(Roberts-銅法標準曲線)和y3=0.000147x3+0.003168(Haze-酒精沉淀法標準曲線)，換算后得到葡聚糖含量，如表2、表3所示。

表2 酶解法與Roberts-銅法測定甘蔗汁中葡聚糖含量對比

表3 酶解法與Haze-酒精沉淀法測定原糖中葡聚糖含量對比

從表2、表3可以看出，酶解法與Roberts-銅法及Haze-酒精沉淀法測定葡聚糖含量相差不大，誤差均不超過±10%，在制糖誤差允許范圍之內。用Roberts-銅法測定甘蔗汁中葡聚糖含量時，其相對誤差主要表現為正誤差，這可能是因為Roberts-銅法需反復洗滌、多次過濾，操作步驟過多，使得葡聚糖流失過多。

3 結論

(1)葡聚糖酶對不同分子量葡聚糖的分解效果是相同的，分解率為56.0%。

(2)最適酶解時間隨葡聚糖標準溶液濃度的不同而不同。

(3)用酶解法定量測定葡聚糖含量，其測定值與Roberts-銅法及Haze-酒精沉淀法(國標)相差不大，誤差均不超過±10%。

(4)酶解法定量測定葡聚糖含量具有高效、專一性強、污染小、操作簡單、酶解產物分布穩定等優點、但存在耗時長、葡聚糖酶不能完全分解葡聚糖等缺點。

參考文獻：

[1] 吳颯麗.蔗汁中葡聚糖的測定及葡聚糖含量的變化特性研究[D].南寧：廣西大學，2007.

[2] 周文紅，劉慧霞，張建法，等.葡聚糖含量使糖度測定值虛假增加的影響研究[J].廣西糖業，2009，(3)：38-41.

[3] 梁達奉,曾練強,郭亭,等.葡聚糖對制糖工業的影響及對策(上)[J].甘蔗糖業，2008，(3)：28-33.

[4] 譚海平.α-1，6-葡聚糖酶的研究進展[J].國外醫學：口腔醫學分冊，2001，28(1)：14-16.

[5] Roberts Earl J. A quantitative method for dextran analysis[J].Int Sugar J,1983,85(1009): 10-13.

[6] GB 15108-2006，原糖[S].