光皮木瓜多糖的純化及含量測定

2010-06-04 08:09:08劉繼延,劉學清

化學與生物工程 2010年4期

光皮木瓜(Chaenomelessinensis)為薔薇科光皮木瓜屬植物,又名海棠、土木瓜,其形狀、功用與木瓜相近,易被誤作木瓜使用[1]。光皮木瓜在我國南北均可生長,以湖北、陜西、安徽、浙江等地分布較多。光皮木瓜多糖是光皮木瓜的有效成分之一，不僅有抗炎、抗病菌、抗衰老、抗腫瘤等作用[2], 而且對燒傷導致的傷口潰爛具有獨特的療效，能有效促進傷口的愈合。

準確測定木瓜多糖含量對選擇原料、評價提取和純化工藝非常重要。多糖的檢測方法大致可分為兩大類:物理方法有高效液相色譜法、氣相色譜法和質(zhì)譜法;化學方法有斐林法、苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法。由于物理方法需昂貴的儀器，其應用受到限制，而化學法簡單、快速、無需多糖純品和精密儀器,因而應用廣泛[3,4]。作者曾詳細研究了光皮木瓜多糖的提取工藝[5]。在此基礎(chǔ)上，用三氯乙酸對熱水浸提的光皮木瓜多糖進行精制，去除其蛋白質(zhì)，并采用苯酚-硫酸法測定了光皮木瓜的多糖含量，對測定條件進行了優(yōu)化。

1 實驗

1.1 材料、試劑和儀器

光皮木瓜于9月份采自陜西省白河縣,洗凈,在真空烘箱中于60℃連續(xù)烘干，用樣品粉碎機粉碎至200目過篩,得到光皮木瓜干粉。

葡萄糖(標準品)；硫酸、苯酚、95%(體積分數(shù))乙醇，分析純；實驗用水為二次蒸餾水。

UV-2401型紫外可見分光光度計，日本島津；LGJ-18型真空冷凍干燥機，湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 光皮木瓜多糖的提取

稱取10 g光皮木瓜粉置索氏提取器中,依次用約90 mL石油醚、乙醚回流提取4 h。殘渣揮干溶劑后倒入250 mL三口燒瓶中，繼續(xù)用水回流，過濾。將濾液倒入燒瓶中經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，-18℃冷凍干燥至恒重。熱水提取條件為：提取溫度90℃、提取時間6 h、液固質(zhì)量比70∶1。

1.2.2 光皮木瓜多糖的純化

取光皮木瓜多糖粗提液加入一定體積10%三氯乙酸溶液,靜置24 h，4000 r·min-1下離心10 min ,傾去上清液,沉淀干燥后稱重。上層清液濃縮至一定體積后,用95%乙醇沉淀，使含醇量達80% ,于冰箱冷藏靜置48 h后,濾取沉淀, -18℃冷凍干燥至恒重，得純化的光皮木瓜多糖。

1.2.3 葡萄糖標準曲線的繪制

5%苯酚試劑的配制：稱取12.5 g苯酚，加適量去離子水溶解，移至250 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，置冰箱內(nèi)備用。

將葡萄糖標準品配成濃度為100.8 μg·mL-1的葡萄糖標準溶液,準確移取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL于10 mL比色管中，分別加水至1.0 mL，然后再分別加入5%苯酚1.5 mL、濃硫酸6.0 mL，搖勻，靜置25 min，在波長490 nm處測定吸光度，以1.0 mL蒸餾水作空白，繪制標準曲線并擬合得到回歸方程。

1.2.4 換算因子的測定

精確稱取干燥恒重的精制光皮木瓜多糖40 mg，加入適量水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容，搖勻，即為多糖儲備液。移取儲備液0.2 mL，稀釋至1 mL，按1.2.3方法測定吸光度，并依式(1)計算換算因子(f)。

(1)

式中：m為多糖質(zhì)量，μg；c為多糖液中葡萄糖的濃度，μg·mL-1；D為多糖的稀釋倍數(shù)。本實驗中m=40，D=5,計算出換算因子f為0.465。

1.2.5 多糖含量測定

精確稱取光皮木瓜粉2.5 g，按照1.2.1方法提取多糖，粗提液定容于100 mL容量瓶中制成樣品液，精確吸取樣品0.20 mL，稀釋至1.0 mL。按1.2.3方法測定吸光度，并依式(2)計算多糖含量。

(2)

式中：c1為樣品溶液中葡萄糖濃度，μg·mL-1；D1為樣品的稀釋倍數(shù);m1為樣品的質(zhì)量，μg。

2 結(jié)果與討論

2.1 粗多糖中蛋白質(zhì)的去除

以蒸餾水為參比, 在200～340 nm 波長范圍內(nèi)對光皮木瓜粗多糖水溶液進行掃描, 結(jié)果見圖1。

圖1 光皮木瓜多糖UV吸收曲線

從圖1可看出，光皮木瓜粗多糖的紫外吸收特征表明樣品中既含有多糖(最大吸收在200～210 nm 附近),同時也含有少量的蛋白質(zhì)(最大吸收在280 nm 附近)。因此,首先需要對粗多糖進行除蛋白質(zhì)處理。

本研究選用三氯乙酸法去除蛋白質(zhì)，結(jié)果見表1。

表1 多糖溶液在278.6 nm的吸收值與三氯乙酸用量的關(guān)系

從表1可知，A值隨三氯乙酸用量的增加而減小，在三氯乙酸用量超過0.7 mL后，變化逐漸趨緩。稱量沉淀的質(zhì)量，得到粗多糖中蛋白質(zhì)含量為1.19%。光皮木瓜多糖去除蛋白質(zhì)后的UV光譜見圖 1。

從圖1可看出，采取三氯乙酸法去除光皮木瓜多糖中的蛋白質(zhì)后，多糖在278.6 nm處的吸收明顯削弱?？紤]到提純次數(shù)太多會造成多糖損失大，因此本研究依據(jù)表1結(jié)果，確定采用三氯乙酸提純3次，每次用量0.7 mL,得到精制的光皮木瓜多糖。

2.2 多糖含量的測定

2.2.1 標準曲線的測定

苯酚-硫酸法測得葡萄糖標準曲線數(shù)據(jù)見表2。

表2 葡萄糖標準曲線數(shù)據(jù)

由表2擬合回歸方程為y=0.01522x+0.00128，R=0.9881,式中：y為吸光度；x為葡萄糖濃度,μg·mL-1。

2.2.2 顯色條件對木瓜多糖含量測定的影響

苯酚-硫酸法測定多糖含量,其原理是根據(jù)多糖在硫酸的作用下先水解成單糖分子,并迅速脫水生成糖醛衍生物,然后與苯酚生成橙黃色化合物,再以UV法測定。在測定多糖含量時,因難以得到相應的多糖對照品,通常以葡萄糖等單糖作為對照,測定結(jié)果則以單糖來表示多糖的含量。采用苯酚-硫酸法測多糖含量的關(guān)鍵操作環(huán)節(jié)是顯色。有報道認為,影響顯色的重要因素是顯色溫度、顯色時間、苯酚及硫酸的用量。本研究以顯色后490 nm 處的吸收值為指標,考察了幾個主要因素對縮合反應進行程度的影響，結(jié)果見表3～表6。