優(yōu)勢降酚菌的篩選及其生長條件優(yōu)化研究

苯酚及其衍生物是重要的有機化工原料，主要用于生產(chǎn)酚醛樹脂、己內(nèi)酰胺、雙酚A、己二酸、苯胺、烷基酚以及水楊酸等，存在于許多工業(yè)廢水中[1]，已被列入優(yōu)先控制的污染物[2]。

目前，含酚廢水的處理方法很多[3]，其中生物法因經(jīng)濟、高效且無二次污染等優(yōu)點而得到越來越廣泛的應用[4]，利用純菌種和混合菌種降解酚類物質(zhì)一直受到關注[5]，并已發(fā)現(xiàn)和分離了多種降酚菌株。然而這些研究往往集中于菌種降解苯酚的工藝條件，對培養(yǎng)過程中優(yōu)勢菌的生長情況涉及較少。事實上，決定微生物生長和降解活力的環(huán)境因素對保持其高降解活性起著十分重要的作用[6]。

鑒于苯酚具有酚類化合物的各種理化性質(zhì)，且毒性大、含量高、用途廣，故作者在此以苯酚作為含酚廢水中酚類物質(zhì)的典型化合物進行優(yōu)勢降酚菌的篩選，并以所選菌株為研究對象，以OD600作為菌株生長狀況的考察指標，確定菌株的最佳生長條件，擬為降解菌株大規(guī)模培養(yǎng)與實際應用提供理論依據(jù)。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 菌種

菌種，篩選自某石化廠的活性污泥。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，加蒸餾水定容至1 L，pH值7.2～7.6，用于菌種的富集和保存。

篩選培養(yǎng)基：KH2PO40.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl20.1 g，NaCl 0.2 g，MnSO4·H2O 微量，F(xiàn)eSO4·7H2O微量，NH4NO31.0 g，根據(jù)需要，加入苯酚若干，加蒸餾水定容至1 L，pH值7.0。

固體培養(yǎng)基：于富集培養(yǎng)基和篩選培養(yǎng)基中加入質(zhì)量濃度為1.5%的瓊脂，用于菌種的分離與保存。

1.2 方法

1.2.1 含酚廢水的配制

在篩選培養(yǎng)基中加入一定量的苯酚，配制成苯酚濃度為1000 mg·L-1的含酚廢水。

1.2.2 菌種的選育

活性污泥經(jīng)馴化、分離及篩選，得到一株苯酚降解菌，命名為JF-6，初步鑒定為Diaphorobacter屬。該菌株具有很強的降酚能力，在接種量為6%(體積分數(shù))、培養(yǎng)24 h的條件下，對500 mg·L-1、800 mg·L-1、1000 mg·L-1、和1200 mg·L-1的苯酚降解率分別是100%、100%、100%和89%，并且在苯酚濃度為1800 mg·L-1的液體培養(yǎng)基中生長良好(OD600為0.763，含1000 mg·L-1苯酚的液體培養(yǎng)基的OD600為0.949，兩者相差不大)。

1.2.3 菌株生長條件的優(yōu)化

考察溫度、pH值、外加氮源、NaCl濃度和溶解氧(裝液量)等環(huán)境條件對苯酚降解率的影響，具體方法為：取配制好的含酚廢水50 mL于100 mL三角瓶中，加菌懸液3 mL，以溫度30℃、pH值7.0、外加氮源為蛋白胨、鹽濃度(即NaCl濃度，不包括培養(yǎng)基中的鹽)200 mg·L-1、轉(zhuǎn)速150 r·min-1的恒溫水浴振蕩搖床培養(yǎng)為初始條件，用控制變量法(即每次只變化一個因素，其它因素保持不變)進行單因素實驗，以OD600為考察指標，確定菌株最適生長條件。

1.3 苯酚降解率的測定

采用4-氨基安替吡啉直接吸光光度法[7]測定苯酚降解率。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度對苯酚降解率的影響

溫度對微生物生長的影響具體表現(xiàn)在[8]：(1)影響酶的活性，溫度變化影響酶促反應速率。溫度過高，會降低酶的活力甚至使酶失活；溫度過低，酶的活力也會受到影響。(2)影響細胞質(zhì)膜的流動性。溫度高，流動性大，有利于物質(zhì)的運輸；溫度低，流動性降低，不利于物質(zhì)的運輸，因而溫度變化影響到營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝物質(zhì)的分泌。

不同溫度下，JF-6菌株培養(yǎng)24 h時的生長情況見圖1。

圖1 溫度對JF-6菌株生長的影響

由圖1可以看出，50℃時菌株生長量極低，OD600僅為0.1左右；20～40℃范圍內(nèi)菌株生長狀況較好。因此，確定最適溫度為20～40℃。

2.2 pH值對苯酚降解率的影響

微生物的生命活動、物質(zhì)代謝與pH值密切相關。pH值對細菌生長的影響主要通過細胞膜的透性、膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、物質(zhì)的溶解性或電離性來影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而影響細菌的生長速率。

不同pH值下，JF-6菌株培養(yǎng)24 h時的生長情況見圖2。

圖2 pH值對JF-6菌株生長的影響

由圖2可以看出，當pH值為3和10時，OD600較低，菌株生長狀況較差，同時培養(yǎng)基顏色較清，不混濁，說明JF-6菌株基本停止生長；當pH值為4～9時，JF-6菌株生長較好。因此，確定JF-6菌株的適宜pH值為4～9。

2.3 外加氮源對苯酚降解率的影響

在難降解廢水生物處理過程中，投加補充氮源是經(jīng)常采用的一種補救措施，以提高污泥數(shù)量和性能。外加氮源對JF-6菌株生長狀況的影響見圖3。

圖3 外加氮源對JF-6菌株生長的影響

由圖3可以看出，以蛋白胨為外加氮源時，JF-6菌株生長狀況極好。因此，確定最適外加氮源為蛋白胨。

2.4 NaCl濃度對苯酚降解率的影響

含酚廢水中常常含有很高濃度的鹽分，鹽濃度過高會抑制微生物的生長。因此，為了微生物的生長繁殖，應將含酚廢水中的鹽分控制在一定范圍。

NaCl濃度對JF-6菌株生長的影響見圖4。由圖4可以看出，隨著NaCl濃度的增加，抑制作用逐漸增強。NaCl濃度大于4.0%時，JF-6菌株基本停止生長；NaCl濃度低于4.0%時，JF-6菌株生長良好。因此，確定最適NaCl濃度≤4.0%。

圖4 NaCl濃度對JF-6菌株生長的影響

2.5 溶解氧(裝液量)對苯酚降解率的影響

溶解氧(即裝液量)是好氧微生物生長的重要生長條件。

不同溶解氧下，菌株培養(yǎng)24 h時的生長情況見圖5。

圖5 裝液量對JF-6菌株生長的影響

由圖5可以看出，隨著裝液量的增加，OD600相應降低，說明JF-6菌株的生長受到抑制；但裝液量為40～100 mL·(250 mL)-1時，生長抑制不明顯；當裝液量增加到120～150 mL·(250 mL)-1時，OD600下降顯著。這可能是由于JF-6菌株為兼性厭氧菌的緣故。因此，確定最佳裝液量為40～100 mL·(250 mL)-1。

3 結(jié)論

(1)JF-6菌株在以1800 mg·L-1苯酚為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長良好。

(2)JF-6菌株在培養(yǎng)24 h、接種量為6%(體積分數(shù))的條件下，對500 mg·L-1、800 mg·L-1、1000 mg·L-1和1200 mg·L-1的苯酚降解率分別達到100%、100%、100%和89%。

(3)JF-6菌株適宜的生長條件為：溫度20～40℃、pH值4～9、NaCl濃度≤4.0%、外加氮源為蛋白胨、裝液量為40～100 mL·(250 mL)-1。

參考文獻：

[1] 楊建設, 張冬梅, 陳茂壕，等. 不同苯酚濃度下耐酚優(yōu)勢菌的活力比較[J]. 茂名學院學報, 2002, 12(4):13-17.

[2] 劉瓊玉, 李太友. 含酚廢水的無害化處理技術進展[J]. 環(huán)境污染治理技術與設備, 2002, 3(2): 62-66.

[3] Bandyopadhyay K,Das D, Maiti B R. Kinetics of phenol degradation usingPseudomonasputidaMTCC 1194[J].Bioprocess and Biosystems Engineering, 1998, 18(5):373-377.

[4] Banat F A, Al-Bashir B, Al-Asheh S, et al. Adsorption of phenol by bentonite[J]. Environmental Pollution, 2000, 107(3):391-398.

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[6] Bastos A E R, Tornisielo V L, Nozawa S R, et al. Phenol metabolism by two microorganisms isolated from Amazonian forest soil samples[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2000, 24(6):403-409.

[7] 牛世全, 胡正嘉. 高效解酚細菌的篩選[J]. 環(huán)境科學與技術, 1991, (2):44-47.

[8] 周群英, 高廷耀. 環(huán)境工程微生物學[M].北京:高等教育出版社, 2002：121.