蠟樣芽孢桿菌對斷奶犢牛生長及腸道菌群的影響

汪麗芬 ，姜俊芳 ，葉宏偉 ，陶 新 ，周衛(wèi)東

（1.浙江農林大學森林保護學院，臨安 311300；2.浙江省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州310004；3.浙江臨安正興牧業(yè)有限公司）

幼齡反芻動物消化道內有益微生物的定植與優(yōu)勢菌群的形成對其營養(yǎng)物質的消化吸收和健康生長至關重要，但出生時，其消化道內并無微生物，主要通過與母體和環(huán)境中附著的微生物接觸，經過消化道環(huán)境的適應和選擇，經定植、存活和繁殖，逐步建立較穩(wěn)定的微生物區(qū)系［1］。反芻動物消化道內大多數有益微生物是厭氧菌，因此，消化道厭氧環(huán)境對于幼齡動物消化道微生物區(qū)系的形成與穩(wěn)定具有積極意義。

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）為革蘭氏陽性大腸桿菌，為需氧菌，也能厭氧生長，能夠分解飼料中的糖分，形成酸性厭氧環(huán)境，對消化道內耐酸、厭氧微生物有利；其分泌的酪蛋白酶、淀粉酶、卵磷脂酶、青霉素酶和超氧化物歧化酶等可促進動物對營養(yǎng)物質的消化吸收，維護消化道健康；同時，其本身含有豐富的菌體蛋白，可為機體提供營養(yǎng)物質［2］。試驗通過梯度飼喂蠟樣芽孢桿菌活菌劑，研究其對斷奶犢牛的生長及腸道微生物菌群的影響，以期為犢牛的健康飼養(yǎng)提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物 選擇90日齡左右、健康的黑白花犢牛24頭（♀，45日齡斷奶），根據體重和出生日期分成3組（每組8頭），即對照組、試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組，試驗牛組間體重無顯著性差異（表1），日齡分布基本一致。試驗期為90 d，分前期和后期，各45 d。試驗在浙江臨安正興牧業(yè)有限公司奶牛場進行。

1.2 飼料 試驗牛基礎飼料由精料、苜蓿草顆粒和苜蓿干草組成。精料為農標普瑞納（嘉興）飼料有限公司的超級小牛精料補充料，飼喂量2 kg/（頭·d），苜蓿干草為自由采食，苜蓿草顆粒在試驗前期投喂，平均為2kg/（頭·d）。

蠟樣芽孢桿菌劑（粉狀）由國外某飼料公司惠贈，活性孢子數為1010CFU/g。用4號粉將原菌劑稀釋50倍，試驗Ⅰ組投喂15 g/（頭·d）（約含3×109CFU），試驗Ⅱ組投喂30 g/（頭·d）（約含6×109CFU）。稀釋菌劑與精料混合后投喂。混合方法：取200 g左右精料于塑料桶中，加適量水潤濕精料，按照各組的投喂量，逐一加入蠟樣芽孢桿菌稀釋菌劑，適當攪拌混合。

1.3 飼養(yǎng)管理 精料和苜蓿草顆粒按照定量每天分早、中、晚3次平均飼喂，自由飲水。蠟樣芽孢桿菌劑投喂方法：每天中午喂料前，按照上述方法逐頭制作稀釋菌劑與精料混合料，將飼料桶固定在特制的鐵架中（可放置8個飼料桶），每天按照對照組（無添加）、試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組的順序，先于其它飼料一次性投喂。試驗期間其它管理按奶牛場常規(guī)程序進行。

1.4 體重和采食量測定

1.4.1 體重 分別于試驗初和試驗末早晨空腹稱重。

1.4.2 采食量 分別于試驗期中（試期第45天）和末（試期第90天）各測定一次精料和粗料的日采食量。分類稱重并記錄當日飼料投喂量，回收并稱重剩余量。

1.5 腸道微生物區(qū)系分析

1.5.1 糞樣采集 分別于試驗初和試驗末逐頭采集糞樣于離心管中，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 細菌DNA提取 取0.2 g糞樣溶解于6mL PBS液（0.1 M，pH=8），經1 000 r/min離心 5 min后，收集上清液，重復2次，將收集的上清液12 000 r/min離心10 min，收集沉淀。采用細菌基因組DNA提取試劑盒（拜爾特普生物科技發(fā)展有限公司，北京）提取糞樣細菌DNA，操作參照試劑盒說明進行。

用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取細菌DNA的完整性，用NanoDropRND-1000核酸定量儀（Thermo Scientific，Waltham，USA）測定DNA含量，確定模板用量為2.5 μL，DNA提取物于-20℃保存。

1.5.3 PCR擴增 對細菌DNA的16S rDNA V6/V8片段進行PCR擴增，引物為帶有GC夾子的U968-GC（F）和L140l（R）［3］，U968-GC 序列為：5′-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3′，L140l 序 列為：5′-GCG TGT GTA CAA GAC CC-3′；引物委托上海英俊生物技術有限公司合成。PCR擴增試劑盒（Premix Ex Taq Version 2.0）購自寶生物工程（大連）有限公司，預計擴增產物片段長約500 bp。

反應體系：0.2 μL U968-GC（10 mΜ），0.2 μL L140l（10 mΜ），12.5 μL Premix（TaKaRa Ex Taq：1.25 u/25 μL，2×dNTP Mixture：0.4mM，2× ExTaq Buffer：4mM Mg2+），2.5 μL 模板 DNA，用 ddH2O 加至 25 μL。

擴增過程：94℃預變性4 min；94℃變性30 s，57.6℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，35 個循環(huán)；72℃延伸 10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR反應產物擴增效果，4℃保存。

1.5.4 DGGE電泳 每組各選取5個樣品，參照Muyzer等［4］建立的方法進行DGGE電泳：使用8%變性聚丙烯酰胺凝膠，100%變性儲存液中加入40%（V/V）甲酞胺和7 M尿素，變性梯度為29%～48%。PCR產物采用DCodeTM 突變檢測系統(tǒng)（Bio-Rad，Hercules，USA）進行分離。運行條件為：0.5×TAE電泳緩沖液，樣品點樣量為10 μL，在200 V、60℃下電泳4 h。電泳結束后用快速銀染法染色。

1.5.5 微生物區(qū)系的相似性分析 DGGE電泳凝膠在凝膠成像儀（Bio-Rad，Hercules，USA）中成像，采用該公司Quantity one軟件的算術平均非加權成組配對法（unweighted pair group method with averaging algorithm，UPGMA）進行相似性聚類分析。

1.5.6 微生物區(qū)系的多樣性分析 DGGE圖譜多樣性指數分析［5-6］包括：

豐富度（richness，S）：DGGE圖譜每條泳道上的條帶數；

香濃維納指數（Shannon-Wiener index，H′）：H′=-∑Piln Pi。其中：Pi為第i條泳道上條帶吸光度與該泳道所有條帶吸光度總合的比值；

菌群均勻度（evenness，E）：E=H′/H′max，H′max=ln S。

1.6 數據處理 結果采用Microsoft Excel整理和統(tǒng)計分析，用單因子方差分析（ANOVA）對各組間進行統(tǒng)計檢驗，如有顯著統(tǒng)計差異（P＜0.05），再采用Tukey分析比較各試驗組間的差異。結果用平均數±標準誤表示。

2 結果分析

2.1 蠟樣芽孢桿菌對犢牛采食量和體重的影響 梯度飼喂蠟樣芽孢桿菌對斷奶犢牛采食量和體重的影響見表1。除定量的精料補充料外，試驗中期Ⅰ組和Ⅱ組的草顆粒日采食量分別比對照組減少50.79%和32.28%，干草日采食量則分別提高35.14%和16.76%，試驗末期Ⅰ組和Ⅱ組的干草日采食量分別提高21.99%和13.75%。但對照組、試驗Ⅰ組和Ⅱ組間犢牛試驗末體重和試驗期增重無顯著差異（P＞0.05）。

表1 犢牛采食量和體重變化

2.2 蠟樣芽孢桿菌對犢牛腸道微生物區(qū)系的影響 經檢測，犢牛糞樣細菌DNA長度大于5 kb，完整性較好。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測到500 bp左右基因片段，與預期結果相符，目的區(qū)以外的電泳條帶特異性較強，非特異性彌散很弱（圖1），可用于下一步DGGE電泳。

圖1 試驗初（A）、末（B）犢牛腸道微生物16S rDNA V6-V8 PCR擴增

2.3 DGGE電泳圖譜相似性分析 試驗初犢牛腸道中可以分離到較多條帶（圖2A），UPGMA相似性分析顯示，整體相似性系數為0.58（圖3A），且各組間互相交雜在一起，各組間無明顯聚集。試驗末亮條帶數高于對照組，位置也有所不同，整體相似性系數為0.45（圖3B），低于試驗初（圖2B）；對照組條帶相對分散，而試驗組相對聚集，可聚為一簇（除15），但試驗Ⅰ組和Ⅱ組相互交叉。

2.4 DGGE電泳圖譜多樣性分析 試驗初、末各組犢牛腸道微生物區(qū)系豐富度、香濃維納指數和均勻度分別在26.20～28.20、3.19～3.28 和 0.975～0.995 之間，與對照組相比，試驗末各試驗組無顯著差異（表2）。

圖2 試驗初（A）、末（B）犢牛腸道微生物區(qū)系16S rDNA V6-V8區(qū)DGGE圖譜

圖3 試驗初（A）、末（B）犢牛腸道微生物區(qū)系DGGE圖譜UPGMA相似性聚類分析

表2 試驗初、末犢牛腸道微生物DGGE圖譜多樣性分析

3 討論與結論

3.1 蠟樣芽孢桿菌劑可以影響斷奶犢牛對粗飼料種類的選擇性 飼喂蠟樣芽孢桿菌可以明顯提高犢牛對干草的采食量，減少對草顆粒的采食量，由于試驗前期干草和草顆粒采食量增減相抵，且試驗后期試驗組干草采食量增量占總采食量的比重較低（試驗組平均為10.5%），時間較短（后期45 d），不足以反映到最終的體重和增重上。楊利等［7］用富含嗜酸乳酸桿菌的發(fā)酵乳飼喂犢牛，獲得與本試驗類似的結果。但曹國文等［8］在斷奶仔豬和王磊等［9］在幼兔的試驗顯示，飼喂蠟樣芽孢桿菌可分別提高日增重33.6%和19.0%。表明蠟樣芽孢桿菌可影響幼齡反芻動物對粗飼料種類的選擇性，但短期內對犢牛的增重影響不大。

3.2 蠟樣芽孢桿菌劑可以改變犢牛腸道微生物區(qū)系的聚類性 PCR-DGGE圖譜分析顯示，試驗初犢牛腸道中已有較多條帶，表明斷奶犢牛腸道內已有較豐富的微生物存在。飼喂蠟樣芽孢桿菌明顯改變了犢牛腸道微生物區(qū)系的聚類性，表明蠟樣芽孢桿菌可使犢牛腸道內微生物菌群發(fā)生變化。但是，飼喂蠟樣芽孢桿菌劑對犢牛腸道微生物區(qū)系多樣性指數均無顯著影響，這與楊利等［7］用富含嗜酸乳酸桿菌的發(fā)酵乳飼喂犢牛的試驗結果一致。于萍等［10］認為，日糧組成和宿主是影響腸道微生物區(qū)系的兩大主要因素；幾種活菌定植性研究［11］表明，健康動物消化道菌群之間相互依賴、相互拮抗，處于相對穩(wěn)定狀態(tài)，不因飼喂微生態(tài)制劑種類、數量而發(fā)生顯著改變。研究結果證實了短期內飼喂外源性微生物對幼齡反芻動物腸道微生物區(qū)系多樣性影響有限。

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