蒙古羊Hoxd11基因CpG位點分布特征分析

趙 靜 ，張立嶺 ，2，巴 圖

（1.內蒙古農業大學動物科學學院，呼和浩特 010018；2.海南大學動物科學系，海口 570228；3.內蒙古農牧科學院畜牧研究所）

在哺乳動物胚胎早期，從受精到8細胞時期，真核基因組DNA是去甲基化的。從8細胞時期到桑椹胚，基因組DNA開始進行甲基化。在囊胚時期，完成甲基化。這個過程稱為表觀遺傳修飾。DNA甲基化是DNA在復制后由DNA甲基轉移酶（DNA methyl-transferase,Dnmt）催化，將甲基轉移到胞嘧啶第5位的碳原子上而形成5-甲基胞嘧啶（5mC）［1］。胞嘧啶容易發生甲基化，單個的甲基化胞嘧啶具有高度的自發性突變的趨勢。胞嘧啶第5位碳原子的甲基化，不改變DNA分子的雙螺旋構型[2]，也沒有改變這種規律或者產生新的排列限制。DNA的雙螺旋結構在轉錄時，由于解旋和解鏈，而不再存在大溝小溝的三級結構。許多實驗證明，如果沒有經歷正常的DNA甲基化過程，動物胚胎不能正常發育。基因剔除、轉基因以及體細胞克隆生成的胚胎常常會在囊胚時期死亡，或者出生后發育異常，包括巨大胎兒、生長過快及早死等現象［1］。

哺乳動物的Homeobox基因的1～3表達位置在頭部枕骨區，4～6在頸椎區（包括第一胸椎），7～9在胸腰區，10～11在腰薦區，12～13在薦尾區。基因Knockout實驗證明，鼠的Hoxc-8突變可使胸椎增加一個，隨之肋骨也多生一對［3］。Hoxd11突變則導致鼠的腰椎或薦椎增加一枚［4］。

世界各地的大多數綿羊品種，除了頸椎都是7枚以外，胸、腰椎數目以13+6組合為主，13+7和14+6組合型少見，14+7組合極少見。但是，蒙古羊與其它品種綿羊不同，胸、腰椎的數目多見13+7和14+6組合型，14+7組合型也達到5%左右。這種胸腰椎數的變異，以非孟德爾方式遺傳。公羊的胸腰椎數對后代的影響最明顯，而母羊的多胸腰椎性狀對后代沒有影響。最近的研究表明，不同品種綿羊胸椎和腰椎數目的變異，與動物的主軸骨發育的調控基因homeobox C8和homeobox D11第一外顯子序列的胞嘧啶甲基化的數量和位置有關，這兩個基因是否表達，取決于基因來自父系，還是來自母系。其遺傳規律和表達方式具有明顯的表觀遺傳特征[5]。

關于胞嘧啶甲基化對基因功能的影響，過去有人認為，由于胞嘧啶第5位碳原子的甲基化，導致在甲基周圍形成局部的疏水區，這一區域擴伸到B-DNA的大溝中，使B-DNA→Z-DNA。即胞嘧啶的甲基化改變了DNA分子的構型，使基因的轉錄停止［2］。但是，這個推測是不成立的。因為胸腺嘧啶第5位碳原子同樣有一個甲基，單鏈DNA上的4種堿基排列是多種多樣的，并無限制。

胞嘧啶的甲基化，無論從DNA的二維還是三維空間來看，都沒有改變這種規律或者產生新的排列限制。而且DNA的雙螺旋結構在轉錄時，由于解旋和解鏈，而不再存在大溝小溝的三級結構，所以，胞嘧啶甲基化在結構上沒有改變DNA雙螺旋的構型。基因序列中的胞嘧啶甲基化的生物學功能，無疑存在其他的機制。

研究證明蒙古羊14枚胸椎與Hoxc8基因的第一外顯子甲基化有關，通過對該基因甲基化的定量檢測，可以早期鑒別多胸椎個體［5］。蒙古羊Hoxc8 exon-1的堿基序列中，沒有可能導致Z-DNA構象的CpGpCpGp［3］或ACACACAC序列，不存在具有免疫性或特異性很強的Z-DNA抗體。鑒于Hoxc8 exon-1的甲基化確實與蒙古羊多胸椎性狀有關，本研究利用同樣的思路和技術，分析Hoxd11 exon-1的CpG位點的分布特征，探索以蒙古羊Hoxd11 CpG特征為分子標記，早期識別和選擇多腰椎個體。在此基礎上，進一步分析Hoxd11 exon-1甲基化特征，為進一步闡釋蒙古羊多胸椎性狀的分子遺傳機制，并且應用于多脊椎個體育種提供高新技術支持。

1 材料和方法

2007—2010年分3批，每批采集200只純種成年蒙古羊血樣，檸檬酸抗凝，液氮凍存。羊群來采自內蒙古錫林郭勒盟的東烏珠穆沁旗。用Wizard Genomic DNA Purification Kit（Promega，A1120） 提取蒙古羊基因組DNA。參考NCBI的GenBank相近物種的相應基因序列設計PCR引物，擴增目標序列。測序后，與已知物種序列比對，確認目標基因及其外顯子和內含子，CpG的數量、位置、比例等。

由于在PCR實驗條件摸索和弩表序列的引物篩選過程中，發現蒙古羊Hoxd11序列exon-1中CpG數量多，密度高，導致目標序列的PCR困難，因此，本實驗專門設計了針對高CpG序列的PCR引物以及專門的PCR擴增條件。

Hoxd11全長擴增引物：上游引物：5'-CTCTTGTGCAATCGATGGCTCAGGT-3'；下游引物：5'-CAAAAACAAGTGCCTTCCAGCCC-3'。該引物的擴增產物長度2 197bp，覆蓋整個目標基因。

2 結果

目標序列PCR擴增及測序結果表明，蒙古羊Hoxd11基因全長 1 772 bp，其中 exon-1 為 778 bp（見圖 1），exon-2為236 bp，內含子為758 bp。該基因的全序列已提交 NCBI GenBank，編號（Accession No）為 GU059862。

圖1 Hoxd11全長PCR擴增產物

Hoxd11 exon-1序列的CpG數：共有120個CpG；A，G，C，T的比例分別為12.72%、38.82%、37.92%、10.54%。Hoxd11 exon-2序列的CpG數：共有12個CpG。

由于Hoxd11 exon-1的CpG主要位于exon-1，而exon-2中的CpG極少，而且分布分散，所以，本文重點討論Hoxd11 exon-1的CpG位點的分布。

在Hoxd11 exon-1的120個CpG中，位于遺傳密碼第1～2位的CpG共8個，編碼一種氨基酸（精氨酸，R）。位于密碼的第2～3位的CpG共47個，占所有CpG的39.17%（47/120），分別編碼絲氨酸（S）5個，脯氨酸（P）18個，蘇氨酸（T）2個，丙氨酸（A）22個。由于其余的65個CpG中的堿基C與G分別位于相鄰的2個密碼中，在轉錄翻譯過程中互不相干，故從略。

圖2 蒙古羊Hoxd11 exon-1及其氨基酸序列

3 討論

在蒙古羊Hoxd11序列中，與Hoxc8的exon-1相似[5]，exon-1的CpG含量和分布密度大大高于exon-2。例如，Hoxd11 exon-1 CpG 的比例 30.85%（120×2/778），exon-2 CpG 的比例 10.17%（12×2/236）。Hoxd11 exon-1的 G+C含量為76.74%，高于A+T的含量（23.26%），其中CpG中的G+C含量30.85%。與Hoxc8 exon-1的堿基序列相似，Hoxd11 exon-1的堿基序列中，也沒有可能導致Z-DNA構象的CpGpCpGp序列，或ACACACAC序列［6］，因此同樣不存在具有免疫性或特異性很強的Z-DNA抗體［7］。由于小鼠的Hoxc8和Hoxd11基因的敲除實驗證明，這兩個基因調控胸腰椎的發育和數量變異，多胸椎（T14）與正常胸椎數（T13）的蒙古羊只在Hoxc8的exon-1序列的甲基化上存在差異，所以，可以推斷，Hoxd11 exon-1的CpG甲基化的分布和數量差異，很可能是腰椎數量變異的原因。

由于DNA堿基序列中的甲基化胞嘧啶無論在三維結構上還是在分子軌道參數上，都沒有達到改變DNA雙螺旋結構或造成DNA復制障礙的程度，所以，胞嘧啶甲基化的生物學功能最有可能在DNA→RNA轉錄和翻譯階段起作用，即改變轉錄產物或翻譯結果。甲基化胞嘧啶（5mC）分子的電子數比C分子多7個，所以5mC比C具有更高的電子密度，因此也具有比C更高的基態能量。基因的信息包括堿基的分子結構及其包含的電子信息和能量信息。這些信息具有穩定性和傳遞性，特異性和相干性，其表達與否，取決于來源父系還是母系。

在相同基因的同一密碼中相同位置的胞嘧啶，其中一個未甲基化，另一個甲基化，在翻譯過程中產生不同的氨基酸，這種差異用堿基結構差異無法解釋，所以，必須從新的角度尋找其中的奧秘。密碼和反密碼配對時主要是堿基分子之間的3個氫鍵之間的結合，未參與這3個氫鍵形成的第5位的甲基究竟起了什么作用，這需要根據量子生物學知識，特別是胞嘧啶與甲基化胞嘧啶的分子軌道的多種能量系統的計算結果來確定。關于甲基化胞嘧啶的作用機理，目前，根據分子軌道理論計算結果［8］和甲基化序列分析［5］表明，一是取決于甲基化胞嘧啶分子處于基態還是處于激發態；二是胞嘧啶的甲基化是提高了還是降低了密碼—反密碼的相互識別標準；三是甲基化胞嘧啶在基因的第一外顯子中的數量和排列的密集度；四是甲基化胞嘧啶位于第一外顯子中的三聯密碼的第幾個位置。這4種因素又決定了密碼中的甲基化胞嘧啶與反密碼識別的特異性，從而導致密碼與反密碼選擇與胞嘧啶不同的氨基酸。

在掌握了蒙古羊Hoxd11 exon-1的CpG位點分布特征以后，下一步就是分析這些CpG中的甲基化位點，分布密度及其與蒙古羊多腰椎性狀之間的關系。根據目前的實驗結果（另文發表）可以預測，蒙古羊腰椎數（6個與7個）的差異，與Hoxd11 exon-1的CpG甲基化位點的數量和密度差異是相對應的。這種甲基化差異極有希望成為多腰椎個體的分子遺傳標記，在早期選種中應用，成為提高肉羊產肉性能的新技術。

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［4］Burke A C，C E Nelson BA Morgan，C Tabin.Hox genes and the evolution of vertebrate axial morphology［J］.Development，1995，121:333-346.

［5］陳琦，趙靜，張立嶺.多脊椎蒙古羊Hoxc8 exon-1甲基化分析［J］.中國畜牧雜志，2009，45（23）：10-13.

［6］Wang A H J，Quigley G J，Kolapak F J，et al.Molecular structure of a left-handed DNA fragment at atomic resolution［J］.Nature，1979，282：680-686.

［7］Lafer E M，Moller A，et al.Antibody recognition of Z-DNA［J］.Cold Spring Harbor Symp Quant Biol，1983,47:155-162.

［8］劉次全.量子生物學及其應用［M］.北京：高等教育出版社，1990.