人牙周韌帶細(xì)胞在SGBG/PHBV三維支架材料上分泌功能的研究

陳建洪 黃南楠 唐倩 吳堅

牙周組織在牙周病變過程中因炎癥而被破壞，如何獲得牙周組織結(jié)構(gòu)和功能的重建-即牙周組織的再生，是牙周病研究領(lǐng)域的重要課題。牙周組織缺損的修復(fù)主要針對牙周韌帶、牙骨質(zhì)和牙槽骨的修復(fù)。應(yīng)用組織工程修復(fù)牙周組織缺損為牙周病的治療開辟了一條新途徑。

本實驗中，我們選用第四代的人牙周韌帶細(xì)胞作為種子細(xì)胞，溶膠-凝膠生物活性玻璃(sol-gel bioglass，SGBG)/聚羥基烷酸酯(poly-3-hydroxy butyrate-co-3-hydroxy valerate，PHBV)作為支架材料，通過細(xì)胞支架體外復(fù)合培養(yǎng)的直接接觸實驗，檢測材料對人牙周韌帶細(xì)胞分泌功能的影響，為牙周組織工程支架材料的選擇提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料來源 SGBG/PHBV(華南理工大學(xué)材料學(xué)院提供)。

1.1.2 主要儀器和試劑 全自動CO2培養(yǎng)箱(Forma，USA)，醫(yī)用超凈工作臺(蘇州凈化儀器廠)，倒置相差顯微鏡(Nikon，Japan)，純水系統(tǒng)(Millipore，USA)，高速離心機(jī)(飛鴿，中國)，高糖 DMEM 培養(yǎng)液(Gbico，USA)，胎牛血清(PAA，美國)，胰蛋白酶(Sigma，USA)，MTT 3-(4，5-2 甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(Sigma，USA)，抗波形絲蛋白單克隆抗體(博士德，中國)，抗細(xì)胞角蛋白單克隆抗體(博士德，中國)，倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(Nikon，Japan)，掃描電鏡(PHILIPS XL-30，Holand)，羥脯氨酸試劑盒(南京建成，中國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 PDLCs體外培養(yǎng)［1］取因正畸撥除的第一或第二前磨牙，用組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行原代培養(yǎng)。培養(yǎng)液為含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)。最早第7天，可見組織塊邊緣游出細(xì)胞。待細(xì)胞長滿瓶底約80%時進(jìn)行首次傳代，4～8代細(xì)胞用于實驗。

1.2.2 細(xì)胞來源鑒定 利用免疫組化ABC法進(jìn)行波形絲蛋白單克隆抗體和細(xì)胞角蛋白單克隆抗體染色。

1.2.3 直接接觸法觀察材料形態(tài)和功能

1.2.3.1 支架材料準(zhǔn)備 SGBG/PHBV塊狀多孔支架材料，將塊狀多孔SGBG/PHBV制成5mm×5mm×3mm的方形小塊，過氧化氫等離子低溫滅菌系統(tǒng)消毒，置24孔板內(nèi)用不含F(xiàn)BS的DMEM預(yù)濕過夜后接種細(xì)胞。

1.2.3.2 PDLCs與SGBG/PHBV復(fù)合培養(yǎng) 用0.25%胰蛋白酶消化狀態(tài)良好的細(xì)胞，1000 rpm×5 min離心，將細(xì)胞濃度調(diào)整至 1 ×106/ml，接種于材料上，每塊接種 200 μl，置37℃培養(yǎng)箱中，4 h后補(bǔ)加培養(yǎng)液1～2 ml，以后隔天換液。

1.2.3.3 細(xì)胞功能的檢測 制備細(xì)胞懸液，對照組共設(shè)27孔，細(xì)胞計數(shù)后直接接種于兩塊24孔板，5×104個細(xì)胞/孔。實驗組三維培養(yǎng)接種方法和密度同前，取27塊材料分別培養(yǎng)于兩塊24孔板的27個孔內(nèi)。分別在三維培養(yǎng)后12 h，24 h，48 h，各孔吸出細(xì)胞上清液1 ml，無菌封存，4℃保存。將共組共54份細(xì)胞上清液，按羥脯氨酸試劑盒說明書操作，用分光光度計在550 nm，空白管調(diào)零，測各管吸光度。

上清液中羥脯氨酸含量(μg/ml)=測定管吸光度/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(2 μg/ml)。

換算成相同細(xì)胞數(shù)的羥脯氨酸含量運(yùn)用SPAA12.11軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及來源鑒定 PDLCs傳代后，細(xì)胞大多呈長梭形，少量呈多角形，胞體豐滿，伸展良好，胞漿均勻，核圓，核仁清晰，細(xì)胞排列均勻，密集時呈漩渦狀，火焰狀。免疫組化ABC法進(jìn)行波形絲蛋白單克隆抗體和細(xì)胞角蛋白單克隆抗體染色，細(xì)胞呈波形絲蛋白染色陽性，角蛋白染色陰性，提示細(xì)胞來源為外胚間充質(zhì)。

2.2 化學(xué)比色法測定細(xì)胞分泌功能

表1 上清液羥脯氨酸量(μg/ml)測定值統(tǒng)計分析表()

表1 上清液羥脯氨酸量(μg/ml)測定值統(tǒng)計分析表()

n對照組 實驗組P 12 h 9 0.4829±0.0330 0.5586±0.0640 0.00024 h 9 0.5172±0.0594 0.5880±0.0153 0.01748 h 9 0.5441±0.0470 0.6003±0.0206 0.019

表中可看到，同一時間點內(nèi)對照組與實驗組間行配對t檢驗，相同的時間點內(nèi)，實驗組的上清液羥脯氨酸量，均值均大于對照組。三組配對t檢驗，均為P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異。表示相同時間和細(xì)胞數(shù)的條件下，實驗組的細(xì)胞，分泌更多的膠原，提示細(xì)胞種植在支架材料上的三維培養(yǎng)，更能促進(jìn)細(xì)胞的分泌功能。

3 討論

牙周韌帶細(xì)胞(periodontal ligament cells，PDLCs)是構(gòu)成牙周組織的主要細(xì)胞，在牙周組織修復(fù)過程中，PDLCs起了關(guān)鍵性的作用。但在牙周病損部位，PDLCs來源非常有限，以至于牙周組織很難達(dá)到有效的再生和重建，而組織工程技術(shù)有望解決這一難題。

生物活性玻璃作為一種新型的硬組織修復(fù)材料，具有理想的生物活性及骨重建功能。生物活性玻璃支架植入機(jī)體后最顯著的變化是富含非晶型磷酸鈣表層的形成，可選擇性地吸收血清蛋白，有利于細(xì)胞吸附的成骨細(xì)胞的表型表達(dá)［2］。聚羥基烷酸酯(PHBV)是由細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生的熱塑性生物聚酯，具有良好的組織相容性，作為骨移植組分，具有增強(qiáng)作用，一定時間內(nèi)可完全生物降解［3］。將二者進(jìn)行復(fù)合，制成三維立體多孔材料，既能發(fā)揮PHBV的局部正性壓電效應(yīng)，刺激骨細(xì)胞的生長分化，又能發(fā)揮SGBG的骨傳導(dǎo)作用和材料三維多孔結(jié)構(gòu)的骨誘導(dǎo)作用。研究結(jié)果表明［4］，羥基磷灰石多晶體可吸附粘多糖膠樣層、粘多糖、糖蛋白，從而在SGBG和骨之間形成有機(jī)-無機(jī)界面，這種結(jié)合非常穩(wěn)定，有利于新骨在BG表面的形成和生長。PHBV分子鏈的水解產(chǎn)物的排出及BG表面羥基磷灰石多晶體的形成，對于骨組織在多孔支架上形成、生長和正常的新陳代謝是非常有利的。

進(jìn)行牙周組織工程研究，首要任務(wù)之一是選擇符合牙周組織工程的支架材料。傳統(tǒng)的生物活性玻璃［5，6］，由于是在1400℃左右熔化后經(jīng)一系列后續(xù)加工而成，制備工藝復(fù)雜，性能不夠穩(wěn)定。本研究所用的生物活性玻璃，是利用溶膠-凝膠法低溫制備的納米尺寸的SGBG/PHBV，具有很好的生物相容性。生物活性玻璃，應(yīng)用于單純骨組織修復(fù)的研究較多，但在牙周組織修復(fù)的研究較少。本實驗所用SGBG/PHBV，國內(nèi)未見運(yùn)用于牙周組織工程的研究報道。

細(xì)胞培養(yǎng)法是評價生物材料組織相容性的重要方法，與體內(nèi)實驗相比具有簡便、重復(fù)性好實驗條件易于控制等優(yōu)點。本實驗采用直接接觸法，通過將體外培養(yǎng)的PDLCs接種到SGBG/PHBV三維支架上復(fù)合立體培養(yǎng)，使SGBG/PHBV與牙周組織的主要功能細(xì)胞PDLCs直接接觸，檢測材料對細(xì)胞分泌功能的影響，為SGBG/PHBV構(gòu)建牙周組織工程支架的可能性提供初步的研究數(shù)據(jù)。將高密度細(xì)胞接種在具有一定空間結(jié)構(gòu)，有一定孔隙率，孔徑大小，孔間交通的支架材料上，細(xì)胞在模擬體內(nèi)細(xì)胞的化學(xué)，物理和生物學(xué)條件下，在三維基質(zhì)支架中進(jìn)行培養(yǎng)稱為三維培養(yǎng)［7］。細(xì)胞在三維立體的空間結(jié)構(gòu)中生長，能夠更好地增殖和行使分泌功能。PDLCs的成纖維表型分泌III型膠原，成骨細(xì)胞表型分泌I型膠原。羥脯氨酸特定地存在膠原蛋白中，而不存在于一般的蛋白質(zhì)中。測定上清液中羥脯氨酸含量，可以定量地反映細(xì)胞分泌的膠原含量，研究SGBG/PHBV對PDLCs分泌膠原功能的影響。結(jié)果表明材料對PDLCs的增殖和分泌膠原的功能不但均未見抑止作用，而且細(xì)胞三維培養(yǎng)更能促進(jìn)細(xì)胞的分泌功能。表明SGBG/PHBV和PDLCs具有良好的生物相容性，SGBG/PHBV可進(jìn)一步應(yīng)用于牙周組織工程的研究。

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［6］Oscar Peitl Filho，Guy P，Latorre，Larryl Hench.Effect of crystallization on apatite-layer formation of bioactive glass 45s5.Biomed Mat Res，1996，30:509.

［7］Matsuda N，Kumar NM，Ramakrishnan PR，et al.Evidence for upregulation epidermal growth-factor receptors on rat periodontal ligament fibroblastic cells associated with stabilization of phenotype in vitro.Arch Oral Boil，1993，38(7):559-569.