納米鋁佐劑禽流感疫苗(H5N1)對肉雞外周血中巨噬細胞活性的影響

徐愛平,黎曉敏,祝 明,湛淋麗,馬金花

(1.西南大學動物科技學院,重慶北碚400716;2.重慶市農業學校動物科學系,重慶九龍坡401329)

禽流感是多種家禽共患的重大動物疫病,分布廣,傳播快,已被國際動物衛生組織(OIE)列為A類傳染病。禽流感曾在世界上許多國家流行,造成的損失數不勝數。1997年我國香港地區暴發禽流感,不僅造成損失約達8 000萬港幣,并發生H5N1亞型AIV直接感染人并引起死亡的事件。此后,H5N1亞型禽流感感染人并導致死亡的事例在全球范圍內流行,這引起了人們對禽流感病毒的巨大恐慌。更令人擔憂的是其毒力不斷增強、宿主范圍不斷擴大[2-3],嚴重影響了畜禽業的健康發展及人類自身的安全。目前國內外使用的禽流感疫苗主要是滅活油佐劑疫苗[2-3],但禽流感滅活油佐劑疫苗首免后常常需10～15 d才能產生有效的免疫保護抗體,而在接種至機體產生有效保護抗體的這段時間動物沒有保護性,一旦發生禽流感將造成巨大的經濟損失。另外,機體對油乳苗的吸收速度慢,容易在注射部位形成腫塊,這對于生長周期短的肉雞來說,嚴重影響了胴體品質,因此需尋找一種高效且能誘導機體提前產生抗體的新型疫苗佐劑。納米技術是21世紀的前沿技術,它的推出給這一問題的解決帶來了曙光。1981年Kreuter等首次將納米材料應用于疫苗佐劑,發現納米材料用作疫苗佐劑,包裹或表面結合抗原的納米粒子能使蛋白抗原的表面充分暴露,同時使抗原結構更穩定,且能促進淋巴集結的攝取,在體內能引起強烈的特異的免疫反應[4]。在國內,湯承,呂風林等將納米氫氧化鋁佐劑用于獸醫疫苗也發現,納米材料是一種很好的新型免疫佐劑[5-6]。本課題組采用納米Al(OH)3,通過物理吸附與油乳劑禽流感疫苗中抗原含量相同的禽流感H5抗原(AIV H5),制作AI納米氫氧化鋁佐劑疫苗,以肉雞為試驗對象,研究其對肉雞的免疫效果。本文就肉雞注射疫苗后巨噬細胞活性進行了檢測和分析。

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器 Al(OH)3納米顆粒由本課題組研制,經重慶科美藥友納米生物技術開發有限公司使用激光粒度儀檢測平均粒徑為197.2 nm,顆粒近球形,分布均勻;常規Al(OH)3佐劑由武漢生物制品研究所提供,平均粒徑為1 398.4 nm;禽流感H5N1亞型油佐劑啇品疫苗由廣東永順生物制藥有限公司生產(批號:2008072);納米鋁和常規鋁佐劑禽流感H5N1滅活疫苗由本課研究組制作,制苗用滅活病毒尿囊液由廣東永順生物制藥有限公司提供(批號:2008072),其尿囊液批次、抗原效價及同體積免疫量中的病毒含量與所選對照啇品苗相同;印度墨汁,購于北京市西中化工廠,批號050301;LSZ試劑盒,購于南京建成生物工程研究所(批號20081013)。

1.2 試驗動物分組及處理 1日齡健康雛雞240只,購于榮昌廣順。按常規方法免疫及飼養。14日齡時,將試驗動物隨機分為4組,即油乳劑疫苗組(OE)、納米疫苗組(NAHA),常規無機鋁組(AHA),對照組(C)。每組隨機抽取10只抽血測母源抗體。隨后油苗組左側胸肌注射油乳苗0.5 mL/只,納米疫苗組左側胸肌注射納米佐劑苗0.5 mL/只,常規無機鋁組左側胸肌注射常規鋁疫苗0.5 mL/只,對照組左側胸肌注射滅菌生理鹽水0.5 mL/只。1.3 方法

1.3.1 巨噬細胞吞噬功能的測定(碳廓清試驗)被試4組雞,每組隨機取5只,分別在21日齡、35日齡、49日齡時,每千克體重翅內靜脈注入1∶3稀釋的印度墨汁0.2 mL,并立即計時,注入墨汁后2 min、10 min 分別從心臟采血 20 μ L,加到 2 mL 的0.1%Na2CO3溶液中搖勻,用721分光光度計于600 nm波長處比色,測定光密度 OD值(分別用OD2和OD10表示2 min和10 min時所取血樣的光密度),用0.1%Na2CO3溶液做空白對照。然后將雞處死,取肝臟和脾臟稱重,計算吞噬指數。

吞噬指數a=(體重/肝臟重+脾臟重)×K1/3

說明:a為吞噬指數;K為碳廓清率,K=lg(OD1)-lg(OD2)/T2-T1,OD1、OD2分別為 2、10 min時取血制得的待測液的透光率;T1、T2為注射印度墨汁后的采血時間。

1.3.2 血清溶菌酶(LSZ)含量的測定 在21日齡、35日齡、49日齡時每組隨機取5只,采血0.5 mL分離血清,將血清與應用菌液反應,測定透光度,計算溶菌酶含量,公式為:溶菌酶含量(μ g/mg)=測定管透光度-空白管透光度)/(標準管透光度-空白管透光度)。具體方法見試劑盒。

1.4 數據分析與處理 所有數據均以平均值±標準誤表示。采用SPSS 13.0統計軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 巨噬細胞吞噬指數的測定 見表1。

表1 巨噬細胞吞噬指數

由表1可知:21日齡時,納米組巨噬細胞的吞噬指數明顯高于其他三組,且與油苗組和對照組差異顯著(P＜0.05);35日齡時,油苗組巨噬細胞的吞噬指數最高,納米組次之,各組差異均不顯著(P＞0.05);49日齡時,油苗組巨噬細胞的吞噬指數依然最高,常規鋁組次之,對照組最低,納米組與其他組差異依然不顯著(P＞0.05)。

2.2 血清LSZ含量的測定 見表2。

表2 血清溶菌酶含量

由表2可知:21日齡時,納米組溶菌酶的含量最高,與油苗組、對照組差異顯著(P＜0.05),與常規鋁組差異不顯著(P＞0.05);35日齡時,從溶菌酶含量數值來看,油乳劑組＞納米組＞常規鋁組＞對照組,其他組與納米組差異不顯著(P＞0.05);49日齡時,油苗組溶菌酶的含量仍然最高,其他組與納米組差異依然不顯著(P＞0.05)。

3 討論

3.1 本試驗分別在21日齡、35日齡、42日齡測定了肉雞巨噬細胞吞噬指數以及血清中溶菌酶的含量,發現21日齡時納米組巨噬細胞的吞噬指數以及血清溶菌酶的含量均明顯高于其他三組,與油苗組和對照組差異顯著(P＜0.05),其他各組之間差異不顯著(P＞0.05),兩項試驗結果基本相同,均表明納米疫苗在肉仔雞生長的早期階段具有促進巨噬細胞活性的作用。丁小波等報道,將氧化鋅納米化,以硫酸鋅為對照,研究其對AA肉雞血液溶菌酶含量的影響,結果顯示,納米氧化鋅能極顯著提高血液中溶菌酶的含量(P＜0.01)且其含量約為硫酸鋅的2倍,表明納米氧化鋅能提高機體的非特異性免疫功能[7]。李艷芬等研究納米二氧化鈦經器官染毒對大鼠肺巨噬細胞免疫功能的影響,結果顯示,不同粒徑的納米二氧化鈦的暴露均可增強大鼠PAM的吞噬功能,大鼠PAM的 NO合成釋放量高于對照組(P＜0.05)[8]。何萍等用納米鋁佐劑吸附HBsAg,研究其免疫學效應時也觀察到與陰性對照組比較,兩組鋁佐劑對小鼠腹腔巨噬細胞非特異吞噬能力均顯著提高(P＜0.05)。采用皮下一次免疫程序,納米鋁佐劑組的OD620值略高于常規鋁佐劑組,結果表明,納米鋁佐劑對提高小鼠腹腔巨噬細胞的非特異吞噬能力強于常規鋁佐劑(雖然二者無顯著性差異)[9]。本試驗結果與上述報道基本一致,納米鋁佐劑輔佐的禽流感疫苗能提高外周血中巨噬細胞的活性,對非特異性免疫有一定的增強作用。

3.2 巨噬細胞主要參與動物機體的非特異性免疫反應,可以通過吞噬作用殺傷病原微生物和腫瘤細胞,還可釋放一些細胞因子和效應分子來發揮多種生物學作用,是機體產生特異性免疫應答的基礎和機體維持內環境穩定的重要因素。大多數抗原經巨噬細胞處理后,免疫原性會大大增強,從而刺激機體產生良好的免疫應答[7],因此,測定機體巨噬細胞的功能,對了解機體的非特異性免疫功能具有非常重要的意義。目前評價巨噬細胞吞噬能力的指標有以下兩個:1.用碳廓清試驗測定吞噬細胞的吞噬指數,以反映機體內單核-巨噬細胞的吞噬活性,巨噬細胞的吞噬能力與其激活程度有關;2.通過測定血清中溶菌酶含量來評價機體吞噬系統功能。據文獻報道,巨噬細胞的碳粒廓清指數反映了單核吞噬細胞系統的吞噬功能[8-9]。顆粒異物經靜脈注射進人血循環后,迅速為單核吞噬細胞所消除,其中主要被定居在肝和脾臟的巨噬細胞所吞噬。胡福良也報道,若將異物量固定,則自血液中消除的速率可以反映單核吞噬細胞的吞噬功能[10]。血清溶菌酶是由巨噬細胞合成并能迅速釋放到細胞外的一種重要水解酶。當血清溶菌酶活力增加時,吞噬細胞活性增加,將導致吞噬細胞產生大量活性物質,這些活性分子對腫瘤細胞、病原體細胞都有強大的殺傷作用,并將進一步調節機體免疫細胞的功能,介導體液免疫和細胞免疫,促進機體的免疫保護機制[11]。高水平的溶菌酶含量表明吞噬細胞處于幾乎活化狀態以及抗原遞呈作用的增強,從而增強機體的抗菌防御機能。

3.3 納米粒子一般是指粒徑在1～100 nm范圍內的超微粒子[12],它具有獨特的生物學性質和載體結構特性。將氫氧化鋁佐劑制備成納米顆粒,具有表面反應活性高、表面活性中心多、吸附能力強等這些優異性質,從而可能吸附更多的抗原,包裹或表面結合抗原的納米粒子能使蛋白抗原的表面充分暴露,同時使抗原結構更穩定,且能促進淋巴集結的攝取,在體內能引起強烈的特異的免疫反應,而且納米材料所運載或包裹的抗原正是巨噬細胞和樹突狀細胞的首選吞噬目標,為實現有效的抗原提呈完成了重要一步,也為機體的免疫應答奠定了堅實的物質基礎。

[1]金寧一.高致病性禽流感的流行及其預防控制[J].中國免疫學雜志,2006,22(1):5-12.

[2]Shane S.Avian influenza.Control and prevent[J].Poultry International,1998,37(4):312-315.

[3]黃建文,何維明,姜艷芬,等.禽流感油乳劑滅活疫苗的研制及應用[J].甘肅農業大學學報,2001,36(4):388-393.

[4]Kreuter J.Haenzel I.Mode of action of immunological adjuvants[J].Eur J Immunol,1982,11:1012-1016.

[5]何萍,呂鳳林,陳月,等.合成納米鋁佐劑及其對乙型肝炎、狂犬病毒輔佐效應的研究[J].免疫學雜志,2006,22(1):90-93.

[6]湯承,岳華,呂鳳林,等.納米鋁佐劑誘導雞提前產生抗AIVH9體液免疫應答[J].西南民族大學學報:自然科學版,2006,32(5):956-958.

[7]丁小波,文利新,王國強,等.納米氧化鋅對AA肉雞血液理化指標的影響[J].黑龍江畜牧獸醫,2008,8:87-89.

[8]李艷芬,劉冉,梁戈玉,等.納米二氧化鈦經氣管染毒對大鼠肺巨噬細胞免疫功能的影響[J].環境與職業醫學,2008,25(2):156-158.

[9]何萍,呂風林,陳月,等.納米鋁佐劑吸附HBsAg及其免疫學效應的研究[J].高等學校化學學報,2005,26(5):886-888.

[10]薛彬.免疫毒理學實驗技術[M].北京:北京醫科大學 中國協和醫科大學聯合出版社,1995.

[11]巴圖德力根,布圖雅.蒙藥清肺湯的抗菌作用及對小鼠非特異性免疫功能影響的實驗研究[J].內蒙古民族大學學報,2002,17(4):352-355.

[12]劉海燕,魏木征.柞蠶蛹蟲草對小鼠非特異性免疫功能影響的研究[J].山東中醫藥大學學報,2004,28(4):304-305.