志賀樣毒素Ⅱ型變異體對(duì)大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌IL-8 IL-6和PGI2的影響

張 偉,索占偉,劉鐘杰,穆 祥,范 開(kāi)

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京海淀100193;2.北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京昌平102206)

志賀樣毒素Ⅱ型變異體[1](SLT-Ⅱe)是豬水腫病大腸桿菌導(dǎo)致仔豬形成水腫病的主要致病因子。研究證明,SLT-Ⅱe能損傷小腸上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞[2],引起細(xì)胞分泌功能障礙,進(jìn)而導(dǎo)致微血管舒縮和通透性發(fā)生變化,最終形成豬水腫病。本試驗(yàn)通過(guò)研究SLT-Ⅱe作用大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(MVECs)后,其培養(yǎng)上清液中 IL-8、IL-6和PGI2的濃度變化,以期從SLT-Ⅱe影響微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能方面,探討SLT-Ⅱe對(duì)大鼠腸黏膜MVECs的損傷機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基(GIBICO公司,U.S.A批號(hào):1348411),D-Hank′s干粉(Sigma公司),胎牛血清(奧地利 PAA Laboratories GmbH 批號(hào):A04105-0180),氧化苦參堿(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所),SLT-Ⅱe粗制品(蛋白含量為10 mg/mL)由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)教研室提供。鑒定試劑:兔抗人第Ⅷ因子相關(guān)抗原抗血清、羊抗兔IgG-FITC,均購(gòu)自Sigma公司。550型酶標(biāo)儀(BIO-RAD公司生產(chǎn))。

1.2 大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng) 選用出生24 h內(nèi)的SD大鼠乳鼠,參照索占偉[3]等的腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法,進(jìn)行微血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)、純化和傳代培養(yǎng)。用免疫熒光法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞vWF因子相關(guān)抗原的方法對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1.3 試驗(yàn)細(xì)胞準(zhǔn)備及處理 試驗(yàn)選用經(jīng)過(guò)鑒定的第5代大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞。將呈80%融合狀態(tài)的腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞以0.25%胰蛋白酶消化,細(xì)胞懸液接種到48孔細(xì)胞培養(yǎng)板,接種密度為 5×105/mL,每孔 250 μ L,置 5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞融合成單層細(xì)胞時(shí)開(kāi)始試驗(yàn)。

1.4 試驗(yàn)分組及指標(biāo)測(cè)定 將培養(yǎng)的融合成單層細(xì)胞狀態(tài)的大鼠腸黏膜MECs分為對(duì)照組和毒素組。每組設(shè)重復(fù)孔3個(gè)(其中PGI2測(cè)量組設(shè)5個(gè)重復(fù)孔),對(duì)照組加含5%血清的維持培養(yǎng)基,毒素組加含15.0 μ g/mL的SLT-Ⅱe的維持培養(yǎng)基,分別培養(yǎng) 3、6、9、12 h 后 ,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,貯存于-20℃冰箱內(nèi)待測(cè)。

1.5 細(xì)胞上清液中IL-8、IL-6和PGI2濃度測(cè)定

IL-8、IL-6和PGI2的濃度測(cè)定按照尚柏公司和USCN LIFE公司提供的 ELISA試劑盒的操作步驟進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 SLT-Ⅱe對(duì)大鼠腸黏膜MVECs不同時(shí)間點(diǎn)分泌IL-8的影響 結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 SLT-Ⅱe對(duì)大鼠腸黏膜MVECs分泌IL-8的影響 pg/mL,n=3)

表1 SLT-Ⅱe對(duì)大鼠腸黏膜MVECs分泌IL-8的影響 pg/mL,n=3)

與對(duì)照組比較,*:P＜0.05;**:P＜0.01;組內(nèi)前后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)相比;△:P＜0.05,△△:P＜0.01

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由表1可以看出,對(duì)照組大鼠腸黏膜MVECs在第3、6小時(shí)和12小時(shí)均有IL-8分泌,且在第6、9小時(shí)和12小時(shí)的分泌量與第3小時(shí)相比,差異極顯著(P＜0.01),說(shuō)明IL-8是大鼠腸黏膜MVECs分泌的細(xì)胞因子之一,其分泌量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和細(xì)胞增殖引發(fā)細(xì)胞數(shù)量上升而增加。

毒素組大鼠腸黏膜MVECs在SLT-Ⅱe作用后的第3、6、9小時(shí)和12小時(shí),IL-8的分泌量均較相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組有顯著升高,說(shuō)明SLT-Ⅱe有刺激大鼠腸黏膜MVECs分泌IL-8的作用。另外,SLT-Ⅱe組4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的IL-8的分泌量相比,后一時(shí)間點(diǎn)IL-8的分泌量均顯著高于前一時(shí)間點(diǎn),說(shuō)明在12 h內(nèi),SLT-Ⅱe具有持續(xù)刺激大鼠腸黏膜MVECs分泌IL-8的作用。

2.2 SLT-Ⅱe對(duì)大鼠腸黏膜MVECs分泌IL-6的影響 結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 SLT-Ⅱe對(duì)大鼠腸黏膜 MVECs分泌IL-6的影響 pg/mL,n=3)

表2 SLT-Ⅱe對(duì)大鼠腸黏膜 MVECs分泌IL-6的影響 pg/mL,n=3)

與對(duì)照組比較,*:P＜0.05;**:P＜0.01;組內(nèi)前后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)相比;△:P＜0.05,△△:P＜0.01

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由表2可以看出,對(duì)照組大鼠腸黏膜MVECs在第3、6、9小時(shí)和 12小時(shí)均有 IL-6分泌,且相鄰兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的分泌量相比,后者顯著高于前者,說(shuō)明IL-6是大鼠腸黏膜MVECs分泌的細(xì)胞因子之一,其分泌量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和細(xì)胞增殖引發(fā)細(xì)胞數(shù)量上升而增加。

毒素組大鼠腸黏膜MVECs在SLT-Ⅱe作用后的第3、6、9小時(shí)和12小時(shí),IL-6的分泌量均較相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組有顯著升高,說(shuō)明SLT-Ⅱe有刺激大鼠腸黏膜MVECs分泌IL-6的作用。

2.3 SLT-Ⅱe對(duì)大鼠腸黏膜MVECs分泌PGI2的影響 結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 SLT-Ⅱe對(duì)大鼠腸黏膜 MVECs分泌PGI2的影響 pg/mL,n=5)

表3 SLT-Ⅱe對(duì)大鼠腸黏膜 MVECs分泌PGI2的影響 pg/mL,n=5)

與對(duì)照組比較,*:P＜0.05;**:P＜0.01;組內(nèi)前后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)相比;△:P＜0.05,△△:P＜0.01

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由表3可以看出,對(duì)照組大鼠腸黏膜MVECs在各時(shí)間點(diǎn)均有PGI2分泌,前后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的PGI2分泌量相比,差異不顯著,說(shuō)明PGI2是大鼠腸黏膜MVECs分泌的細(xì)胞因子之一,其分泌量在12 h內(nèi)處于平穩(wěn)狀態(tài)。

毒素組大鼠腸黏膜MVECs在SLT-Ⅱe作用后的第 3、6、9 h和12 h,PGI2分泌量均較對(duì)照組有顯著升高,說(shuō)明 SLT-Ⅱe有刺激大鼠腸黏膜MVECs分泌PGI2的作用。

3 討論

IL-8主要由單核細(xì)胞、吞噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生,參與趨化和激活嗜中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞等炎性細(xì)胞,促進(jìn)釋放生物活性物質(zhì),增強(qiáng)炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)[4]。IL-6是1980年用Poly I-C刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的一種能抑制病毒復(fù)制的細(xì)胞因子,主要由T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生,具有刺激多種細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞分化,加速肝細(xì)胞急性期蛋白的合成等作用,參與多種炎癥反應(yīng)過(guò)程。

本試驗(yàn)研究證實(shí),對(duì)照組大鼠腸黏膜MVECs在各時(shí)間點(diǎn)均有IL-6和IL-8分泌,證實(shí)大鼠腸黏膜MVECs是IL-6和IL-8分泌的細(xì)胞因子。有研究證實(shí),IL-6和IL-8具有刺激細(xì)胞增殖作用[5]。從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出,對(duì)照組的IL-6和IL-8濃度均隨時(shí)間延長(zhǎng)而上升,其中IL-6分泌量均顯著高于前時(shí)間點(diǎn),第6、9小時(shí)和第12小時(shí)的IL-8分泌量顯著高于同組第6小時(shí)時(shí),說(shuō)明MVECs分泌的IL-6和 IL-8可能作用自身,引起MVECs增殖,最后引起分泌量上升。

大量研究資料證實(shí),IL-6和IL-8與炎癥的發(fā)生具有一定的關(guān)系[6]。IL-8參與趨化和激活嗜中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞等炎性細(xì)胞,IL-6能刺激巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞分化,釋放生物活性物質(zhì),增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出,毒素組各時(shí)間點(diǎn)的IL-6和IL-8濃度均顯著高于對(duì)照組,說(shuō)明SLT-Ⅱe能促刺激大鼠腸黏膜MVECs分泌IL-6和IL-8,有增強(qiáng)炎癥反應(yīng)作用。研究資料證實(shí),在水腫形成過(guò)程中,主要原因可能是SLT-Ⅱe損傷微血管內(nèi)皮細(xì)胞,但是微血管損傷與形成水腫之間的確切作用機(jī)制尚未弄清。本試驗(yàn)結(jié)果研究發(fā)現(xiàn),SLT-Ⅱe能刺激大鼠腸黏膜MVECs顯著增加對(duì)IL-6和IL-8的分泌,說(shuō)明SLT-Ⅱe損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,引起其對(duì)IL-6和IL-8的分泌增加,加重炎癥反應(yīng)進(jìn)程,導(dǎo)致血管通透性發(fā)生改變,這可能就是SLT-Ⅱe引發(fā)豬水腫病的機(jī)制之一。

PGI2是強(qiáng)烈的血管平滑肌舒張劑,能擴(kuò)張血管,抑制血小板聚集,在血栓形成和改變血管通透性方面具有重要作用。從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出,對(duì)照組大鼠腸黏膜MVECs在各時(shí)間點(diǎn)均有PGI2分泌,說(shuō)明PGI2是大鼠腸黏膜MVECs分泌的細(xì)胞因子之一,其分泌量在12 h內(nèi)處于平穩(wěn)狀態(tài)。SLT-Ⅱe在引發(fā)水腫過(guò)程中,有血管通透性增加現(xiàn)象,但有關(guān)通透性形成的確切機(jī)制尚在研究中。從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出,毒素組各時(shí)間點(diǎn)PGI2分泌量均顯著高于對(duì)照組,說(shuō)明SLT-Ⅱe具有刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌PGI2的作用,恰好說(shuō)明SLT-Ⅱe能引起微血管舒張,微血管通透性上升,這可能就是SLT-Ⅱe的致病機(jī)理之一。

綜上所述,SLT-Ⅱe能刺激微血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)IL-8和IL-6的分泌增加,刺激相應(yīng)炎性細(xì)胞增殖,促進(jìn)釋放炎性物質(zhì),加重炎癥反應(yīng),改變微血管通透性,進(jìn)而形成水腫,這可能是SLT-Ⅱe的致病機(jī)理之一;PGI2的分泌增加,其維持微血管正常舒縮的功能失調(diào),導(dǎo)致血管通透性發(fā)生改變,進(jìn)而引起水腫,這可能是SLT-Ⅱe的另一致病機(jī)制。

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