牛新孢子蟲抗體Dot-ELISA檢測方法的建立

賈立軍,張守發

(延邊大學農學院動物醫學系,吉林龍井133400)

新孢子蟲病(Neosporiasis)是由犬新孢子蟲(Neospra caninum)寄生于犬、牛、羊等多種哺乳動物細胞內而引起的一種原蟲病[1-2]。該病主要引起母畜的流產、死胎或新生胎兒的運動障礙和神經系統等癥狀,該病對牛的危害尤為嚴重,可垂直傳播,帶蟲母牛可將蟲體直接傳給新生犢牛,已證實該病是造成養牛業嚴重經濟損失的一個重要原因[3]。雖然國內建立了多種血清學診斷方法,但血清學診斷用抗原均為重組蛋白,其敏感性、特異性將會受到不同程度的影響[4-5]。因此,針對上述問題,本試驗對新孢子蟲蟲體抗原進行了分析,并應用特異性蟲體抗原建立特異、敏感、穩定的Dot-ELISA血清學診斷方法,旨在為今后新孢子蟲病的診斷和預防等研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 新孢子蟲Nc-1株、ICT試紙條均由日本帶廣畜產大學原蟲病研究中心惠贈;RPMI-1640培養基購自北京華美轉導科技有限公司;犢牛血清購自北京元亨圣馬生物工程公司;非洲綠猴腎細胞(Vero)由延邊大學農學院預防獸醫學實驗室保存;牛血清樣本采自延邊地區某養牛場;其他材料由延邊大學農學院預防獸醫學實驗室提供。

1.2 新孢子蟲的體外培養及分離 將凍存復蘇的新孢子蟲Nc-1株接種到已長成單層的Vero細胞培養瓶中,在37℃,5%CO2濃度,飽和濕度條件下進行培養,隔天換液,每天用倒置顯微鏡觀察支撐細胞和新孢子蟲的形態。按常規寄生蟲培養方法傳代培養3代,然后應用27號針頭分離在Vero細胞上培養的新孢子蟲,收集蟲體-20℃冰箱保存備用。

1.3 新孢子蟲抗原的制備及特異性分析 將最終收集的新孢子蟲置-20℃冰箱中反復凍融、超聲波粉碎處理后,以2 000 r/min離心10 min,收集上清液,即為新孢子蟲抗原。將收集的抗原于透析袋濃縮后,用UV-754型紫外分光光度計測定蛋白濃度。采用SDS-PAGE及Western blot對新孢子蟲抗原進行分析,找出具有較好反應原性的抗原。

1.4 Dot-ELISA程序和最佳反應條件的確定

1.4.1 最適抗原包被濃度的確定 在硝酸纖維素膜光面上劃4×4 mm的方格,切成10×4個格的大膜片,于蒸餾水中浸泡 5 min后,取出置室溫或37℃干燥。用碳酸鹽緩沖液(0.1 mol/L,pH 9.6)稀釋抗原 ,按 5 μ g/mL 、10 μ g/mL 、20 μ g/mL 、40 μ g/mL 、80 μ g/mL 進行稀 釋,分別取 1 μ L 點于每一個小方格的正中央,置室溫或37℃干燥,將干燥好的抗原膜片浸于封閉液中,37℃封閉30 min。取出干燥后,將抗原膜片切成小片,放入微量反應板的小孔中,點樣面朝上。將陽性、陰性血清1∶100稀釋后每孔加 50 μ L,37℃感作30 min。用 PBS(0.1 mol/L,pH 7.2)洗3次。加入辣根過氧化物酶標記的羊抗牛IgG 50 μ L,37℃感作30 min。用 PBS洗3次。每孔加入50 μ L顯色液(二氨基聯苯胺5 mg/10 mL,H2O210 μ L/10 mL,pH 7.5)37℃顯色,當陽性血清的抗原小片上呈現深棕色或淺棕色斑點,而陰性血清的抗原小片尚未呈現斑點時甩盡底物液,加雙蒸餾水終止反應,確定最佳抗原量。

1.4.2 血清工作濃度的確定 將陽性血清及陰性血清按 50、100、200、400 倍稀釋,進行 Dot-ELISA,確定血清工作濃度。

1.5 特異性試驗

1.5.1 阻斷試驗 將牛新孢子蟲病陽性血清、陰性血清倍比稀釋后,加入適量的抗原液,于37℃感作1 h,然后Dot-ELISA檢測其抗體滴度,同時以未作任何處理的陽性血清作對照。

1.5.2 交叉反應試驗 用牛新孢子蟲病陽性血清及陰性血清、弓形蟲陽性血清、牛瑟氏泰勒蟲陽性血清進行Dot-ELISA檢測,重復2次。

1.6 重復性試驗 將牛新孢子蟲病陽性及陰性血清1∶100稀釋后,用不同批次的抗原片進行Dot-ELISA檢測,重復4次。

1.7 Dot-ELISA與ICT檢測結果的比較 應用建立的Dot-ELISA對30頭份被檢血清樣本進行檢測,同時進行ICT檢測[6]。

2 結果

2.1 新孢子蟲抗原蛋白濃度的測定 制備的新孢子蟲抗原測定的蛋白質濃度為0.80 mg/mL。2.2 新孢子蟲抗原的特異性分析 新孢子蟲可溶性抗原經SDS-PAGE電泳和Western blot結果顯示,76、63、46 ku和27 ku的抗原與新孢子蟲陽性血清表現出明顯的反應原性,而與陰性血清無特異性反應(如圖1)。

圖1 新孢子蟲可溶性抗原免疫印跡分析

2.3 Dot-ELISA反應參數的確定

2.3.1 最適抗原濃度的確定 Dot-ELISA檢測結果表明,抗原的最適濃度范圍為10～40 μ g/mL。在該范圍內,標準陽性血清呈深棕色斑點,而標準陰性血清不呈現斑點。為了方便計算以20 μ g/mL作為最適工作濃度。

2.3.2 血清工作濃度的確定 將陽性血清及陰性血清分別按 50、100、200、400 倍稀釋,然后進行Dot-ELISA檢測。結果表明當稀釋度為1∶100時,反應強度最高,故選擇1∶100作為最適血清工作濃度。

2.4 特異性試驗

2.4.1 阻斷試驗 未處理的陽性對照血清終點滴度分別為1∶1 600和1∶100,而經診斷抗原處理后滴度分別為1∶50和1∶30,說明反應被特異性阻斷。2.4.2 交叉反應試驗 用弓形蟲陽性血清和牛瑟氏泰勒蟲病陽性血清按所建立的Dot-ELISA進行檢測,重復2次,結果只有陽性對照血清呈現陽性反應,其余均呈現陰性反應。表明所建立的Dot-ELISA具有較高的特異性。

2.5 重復性試驗 將牛新孢子蟲病陽性及陰性血清1∶100稀釋后,用不同批次的抗原片進行Dot-ELISA檢測,重復4次,其變異系數小于10%,說明Dot-ELISA具有良好的重復性。

2.6 Dot-ELISA和ICT檢測結果比較 對30份牛血清樣本的檢測結果見表1。

由表1可見,Dot-ELISA的陽性率為40%(12/30),ICT的陽性率也為40%(12/30),而且Dot-ELISA檢測為陽性的12份樣本ICT檢測也均為陽性,二者的陽性符合率達100%(12/12),說明建立的Dot-ELISA具有較好的敏感性。

表1 Dot-ELISA和ICT對30頭份血清的檢測結果

3 討論

目前,國內外廣泛應用IFAT、ELISA、ICT等方法檢測新孢子蟲病,但使用抗原均為重組蛋白,在不同程度上將會影響檢測結果的敏感性和特異性。本試驗首先對新孢子蟲抗原進行分析,應用含有76、63、46 ku和27 ku的新孢子蟲特異性抗原建立了牛新孢子蟲Dot-ELISA檢測方法。所建立的Dot-ELISA不與弓形蟲病陽性血清和牛瑟氏泰勒蟲陽性血清發生交叉反應,說明該法具有較高的特異性。

IFAT、ELISA、ICT等方法檢測新孢子蟲抗體成本較高,而且需要專門儀器設備和專業人員操作。而Dot-ELISA不但具備常規ELISA敏感、特異等特點,還具有簡便快捷、經濟、無需儀器設備、適合基層獸醫臨床應用等優點。本試驗用Dot-ELISA和ICT同時檢測30頭份被檢血清的結果顯示,二者的陽性符合率達100%。鑒于Dot-ELISA具有特異、敏感、穩定等優點,因此,該方法完全適用于基層獸醫部門進行牛新孢子蟲抗體檢測及該病的疫情監測。

[1]蔣金書.新孢子蟲病研究進展[J].中國獸醫雜志,2002,38(8):36-39.

[2]Frossling J,Bonnet B,Lindberg A,et al.Validation of a Neospora caninumiscom ELISA without a golds tandard[J].Preventive Veterinary Medicine,2003,57:141-153

[3]Huang P,Liao M,Zhang H,et al.The dense granule protein NcGRA7,a new marker for the serodiag nosis of Neospora infection in aborting cows[J].Clin Vaccine Immunol,2007,14:1640-1643,

[4]張守發,丁德,鞠玉琳,等.膠體金免疫層析法與ELISA法對牛的新孢子蟲血清抗體檢測結果的比較[J].中國獸醫雜志,2008,44(8):54-55.

[5]Kang S W,Lee E H,Jean Y H,et al.T he differential protein ex pression profiles and immunogenicity of tachyzoites and bradyzoites of in vitro cultured Neospora caninum[J].Parasitol Res,2008,103(4):905-913.

[6]Min Liao,Shoufa Zhang,Xuenan Xuan,et al.Development of Rapid Immunochromatographic Test with Recombinant Nc-SAG1 for Neospora caninum in Cattle[J].Clinic and Diagnostic Laboratory Immunology,2005,12(7):885-887.