豬細小病毒核衣殼VP2蛋白單克隆抗體的制備及部分特性鑒定

劉秀芬,李一經

(東北農業大學動物醫學學院,黑龍江哈爾濱150030)

豬細小病毒(PPV)是引起母豬繁殖障礙的重要病原之一。懷孕母豬,特別是初產母豬感染后以流產、死胎、木乃伊胎及新生仔豬死亡為臨床特征。因該病流行面廣、危害嚴重,給養豬業帶來重大經濟損失。

PPV屬無囊膜病毒,衣殼蛋白即是病毒表面的結構蛋白。其中VP2蛋白在病毒感染發生,病毒致病性發揮以及誘導機體產生免疫保護反應等方面起著關鍵作用[1]。Tullis G E等研究表明,缺失VP2蛋白的突變體也喪失了對宿主細胞的再感染性[2]。因此豬細小病毒VP2蛋白無論在免疫防治、疾病檢測,還是探討疾病發生機理均是重要的結構蛋白。

基于豬細小病毒VP2蛋白功能特性的重要性,本研究以重組VP2蛋白為免疫原,通過細胞融合技術,制備抗VP2特異性單克隆抗體,并對單抗和分泌抗體的雜交瘤細胞株進行鑒定,為該病及其病原的基礎性或應用性研究提供重要的研究工具。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級8～10周齡BALB/c小鼠,購自黑龍江省醫科大學第二臨床醫院實驗動物中心。

1.2 免疫原 表達豬細小病毒VP2蛋白重組干酪乳桿菌pPG-1-VP2-E290/L.casei393,由本實驗室構建[3]表達的VP2蛋白經SDS-PAGE電泳,切膠純化,PBS稀釋成所需濃度。

1.3 細胞系 SP2/0骨髓瘤細胞、ST傳代細胞,購自武漢大學保藏中心。

1.4 病毒 豬細小病毒(PPV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TEGV)、豬輪狀病毒(PRV)細胞培養毒,由本實驗室分離,-20℃凍存。

1.5 主要試劑 完全與不完全弗氏佐劑、PEG3350、IgG抗體亞類試劑盒均購自Sigma公司;辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗鼠IgG、異硫氰酸熒光素(FITC)標記羊抗鼠IgG均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.6 動物免疫 8～10周齡BALB/c小鼠進行3次腹腔免疫,每次間隔2周,在最后一次免疫3天后取脾臟用于細胞融合。首免抗原為50 μ g重組PPV VP2蛋白PBS與等量弗氏完全佐劑,第2次加強免疫為相同抗原加弗氏不完全佐劑,第3次加強免疫為相同抗原不加佐劑。

1.7 細胞融合 以50%PEG3350為融合劑,脾細胞與SP2/0按8∶1進行融合[6]。每孔脾細胞數不少于1×105個。

1.8 單抗篩選 以PPV細胞培養物作為檢測抗原,對融合細胞培養上清進行檢測,鼠抗PPV VP2血清為陽性對照,SP2/0細胞培養上清為陰性對照,P/N值大于2判為陽性。陽性孔細胞通過3～4次克隆篩選后,擴大培養,凍存。

1.9 腹水單抗制備 將BALB/c小鼠腹腔注入液體石蠟,劑量為0.5 mL/只,7～10 d后腹腔注入雜交瘤細胞約1×105個/只,7～15 d后待腹圍明顯增大后用注射器多次收集腹水,低速離心后,收集上清,所得細胞適當稀釋注入另一只小鼠體內繼續生產腹水抗體。間接ELISA測定腹水抗體效價。

1.10 染色體數測定 將各株雜交瘤細胞和SP2/0細胞分別制備細胞染色體[5],每個細胞取10個形態完整、單在,染色體分散良好、無重疊、無散失的制片樣本進行觀察,計數,求出平均染色體數。

1.11 單克隆抗體亞類鑒定 按抗體亞類試劑盒說明書測定。

1.12 Western blot分析 表達細小病毒VP2 pPG-1-VP2-E290/L.casei393誘導后,進行 SDSPAGE,半干轉印后,各雜交瘤細胞上清液分別進行Western blot抗體檢測。

1.13 間接免疫熒光法鑒定 接種病毒的ST細胞,待出現CPE后,倒去培養上清液,刮取細胞培養物涂片,干燥,冷丙酮固定10 min,0.01 mol/L pH 7.2 PBS洗滌3次,每次3 min,以后分別加雜交瘤細胞上清液和0.01%伊文思藍稀釋的FITC標記的羊抗鼠IgG,37℃60 min,相同方法洗滌,干燥后,鏡檢觀察[6]。

1.14 單克隆抗體與相關病毒的反應性 PPV、PEDV、TEGV和PRV細胞培養物為包被抗原,間接ELISA檢測各株雜交瘤細胞培養上清反應。

2 結果

2.1 雜交瘤細胞株建立 經過多次克隆和篩選獲得了5株分泌抗體的雜交瘤細胞株,分別是2D5、1F11、2B4、3C8和1H3。這5株單抗細胞上清效價分別為1∶5 000、1∶2 000、1∶1 000、1∶800、1∶800,腹水抗體效價分別為1∶106、1∶105、1∶104、1∶104、1∶104,結果表明,腹水效價明顯高于上清效價,體外連續傳代培養3個月及凍存后復蘇均不影響抗體的分泌。說明建立的雜交瘤細胞具有穩定分泌抗體能力。

2.2 染色體數測定結果 染色體計數結果表明,分泌抗體細胞平均染色體數目為87～102條,SP2/0骨髓瘤細胞是56～57條,兩者染色體數目相差明顯,說明篩選的細胞是屬于雜交瘤細胞。

2.3 單克隆抗體亞類鑒定結果 抗體亞類鑒定結果顯示,2D5分泌抗體為IgG2a型,其余4株1F11、2B4、3C8、1H3均為 IgM 型。

2.4 單克隆抗體特異性鑒定結果

2.4.1 Western blot分析 以雜交瘤細胞株Western blot檢測,表達豬細小病毒VP2蛋白的重組干酪乳桿菌pPG-1-VP2-E290/L.casei393經誘導表達后,進行的Western blot分析表明,5株單抗反應后均可在約70 kDa出現反應帶,大小與預期結果相符[7],說明所制備的單抗是針對豬細小病毒VP2蛋白(見圖1)。

圖1 Western blot檢測單克隆抗體

圖2 5株雜交瘤細胞培養上清液對感染PPV的ST細胞進行間接免疫熒光染色結果

2.4.2 間接免疫熒光鑒定結果 以PPV感染的細胞培養物對制備的5株單抗進行的間接免疫熒光反應結果表明,2D5、1F11、2B4、3C8 、1H3,感染病毒的細胞出現明顯的亮綠色熒光反應,而SP2/0細胞培養上清液染色未出現熒光,(見中插彩版圖2),說明所制備的單抗能與PPV發生反應。

2.4.3 單克隆抗體與其他相關病毒的交叉反應性間接ELISA結果表明,5株單抗與PPV反應的OD值明顯高于PEDV、TGEV和PRV。從接種病毒和未接種病毒的P/N值結果看,5株單抗與PPV反應的 P/N值均大于 2,而與 PEDV、TGEV和PRV反應的P/N值大約在1左右(見表1)。上述結果說明,制備獲得的5株單抗與PEDV、TGEV和PRV不發生交叉反應,對PPV具有較強的特異性。

表1 單抗特異性鑒定結果

3 討論

單克隆抗體以其均質性高、特異性強、易于標準化生產等特點,已成為生物領域基礎性或應用性研究的一種重要的工具。本試驗通過細胞融合技術,經過多次克隆篩選獲得了抗體效價高、分泌功能穩定的5株雜交瘤細胞株,通過Western blot檢測表明,5株單抗均識別豬細小病毒VP2蛋白;間接免疫熒光鑒定和與其他相關病毒的交叉反應性也表明,制備的5株單抗具有與豬細小病毒高度反應的特異性,從而為開發利用這些單抗,進行豬細小病毒及其疾病的基礎性或應用性研究提供了重要的工具。5株單抗是否識別豬細小病毒VP2的不同表位以及制備的單抗是否具有中和病毒作用,值得深入探討。

不同抗體亞類出現的時間與免疫發生的不同時期有一定關系,在免疫發生的早期,出現的循環抗體以IgM類為主,隨后出現IgG類。兩類抗體在純化手段,與相應抗原的親和力方面存在差別,目前對IgG類抗體的純化方法相對成熟,而對IgM的純化方法、抗體純化效率均不是令人滿意。本次融合篩選獲得的抗體亞類多以IgM 類為主,只有其中1株為IgG類,是否與最后一次加強免疫較早取脾細胞融合有一定關系,適當推遲融合時間可能對提高IgG類的篩選獲得具有幫助。

利用全病毒為免疫原是制備單克隆抗體的常規方法。本試驗采用純化的重組PPV蛋白為免疫原,因刺激抗原成分單一,提高了針對目的抗原陽性雜交瘤細胞株篩選的頻率;避免了以PPV全病毒抗原為免疫原制備單克隆抗體篩選過程中的大量繁瑣工作和篩選結果的不確定性,也減少了大量培養和純化病毒的繁瑣過程和排散病毒的危險。

[1]Molitor T W,Joo H S,Coliett M S.Porcine parvovirus parvovirus:virus purification and structural and antigenic properties of virion polypeptides[J].J Virol,1983,45(2):842-854.

[2]Tullis G E,Burger L R,Pintel D J,et al.The mino r capsid VP1 of the autonomous parvovirus minute of mice is dispensable for encapsidation of progeny single-stranded DNA but is required for infectivity[J].Virology,1993,67:131-141.

[3]徐義剛,馬廣鵬,李一經,等.豬細小病毒 VP2蛋白在干酪乳桿菌表面的表達[J].生物工程學報,2007,23(2):315-318.

[4]朱立平,陳清學.免疫學常用實驗方法[M].北京:人民軍醫出版社,2000:441-442.

[5]薛慶善.體外培養的原理與技術[M].北京:科學出版社,2001:948.

[6]鄭福英,刁有祥.應用間接免疫熒光法檢測新型鴨瘟病毒[J].中國獸醫科技,2003,33(10):47-50.

[7]徐義剛,唐麗杰,李一經,等.分泌型和非分泌型表達豬細小病毒VP2蛋白的重組乳酸菌經口免疫小鼠的效果分析[J].畜牧獸醫學報,2007,38(12):1405-1409.