高效液相色譜法測(cè)定心脈神膠囊中大黃素含量

曹 健，黃林清，王 芳，朱麗莎，張恩娟

（1.第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院藥學(xué)部，重慶 400037； 2.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)系，重慶 400016）

心脈神膠囊是我院研制的非標(biāo)制劑，由何首烏、黃芪、赤芍等中藥組成，臨床應(yīng)用于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的治療，對(duì)急性心肌梗死恢復(fù)期、心絞痛的防治及缺血性心肌病等，療效較好。大黃素為何首烏的主要有效成分之一，具有涼血解毒、逐瘀通經(jīng)的功效。筆者選用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定了心脈神膠囊中大黃素的含量，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Waters 600型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司），紫外檢測(cè)器；ME 235 s型電子天平（德國(guó)Sartorius）；電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠）；CSF-1A型超聲波發(fā)生器（上海超聲波儀器廠）；CS202A型電熱保溫干燥箱（重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞索生化儀器廠）。大黃素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為0714-9903）；心脈神膠囊（第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院自制，規(guī)格為 0.45 g/粒，批號(hào)分別為 070806，080325，080729）；陰性對(duì)照樣品（缺何首烏）為本院自制。甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS 柱（150 mm ×4.6 mm，10 μm）；流動(dòng)相：甲醇 -0.02 mol/L 磷酸 （75 ∶25）；流速：1.2 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：438 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

精密稱取大黃素對(duì)照品5.5 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇振搖使溶解，定容至刻度，即得對(duì)照品溶液。精密稱取心脈神膠囊內(nèi)容物5 g，加50 mL無水乙醇，在85℃下回流1 h，過濾，濾液于65℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，加甲醇溶解乙醇提取物，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，微孔濾膜（0.45 μm）濾過，即得供試品溶液。精密稱取陰性對(duì)照樣品膠囊內(nèi)容物5 g，按照供試品溶液制備方法制備缺何首烏的陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：將對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液3種溶液分別進(jìn)樣10 μL，高效液相色譜圖見圖1。可見陰性對(duì)照品溶液對(duì)大黃素的含量測(cè)定無干擾。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密量取對(duì)照品溶液 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀測(cè)定。以峰面積（A）對(duì)質(zhì)量濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 A=33 111 090.9 C+396.4，r=0.999 8（n=5）。結(jié)果表明，大黃素質(zhì)量濃度在0.002 2～0.011 0 g/L范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：精密量取對(duì)照品溶液1.0 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，連續(xù)進(jìn)樣10 μL，測(cè)定5次，記錄色譜圖，測(cè)定大黃素對(duì)照品峰峰面積。結(jié)果平均峰面積為216 563，RSD=1.25%（n=5），表明儀器精密度良好。

重現(xiàn)性試驗(yàn)：取同一批供試品5份，按供試品溶液制備方法制備，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果大黃素平均峰面積為207 207.2，RSD=2.5%（n=5）。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液10 μL，于0，5，24 h時(shí)進(jìn)樣，記錄每次進(jìn)樣的峰面積。結(jié)果大黃素平均峰面積分別為213 614，213 280，214 478，RSD=0.29%（n=3），表明供試品溶液在 24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱取已知含量的心脈神膠囊內(nèi)容物2.0 g，共3份，按供試品溶液制備方法制備，分別加入一定量的大黃素對(duì)照品溶液（0.11 g/L）0.5，1.0，1.5 mL，平行操作 5 次，依法測(cè)定。結(jié)果見表1。

2.4 樣品含量測(cè)定

取3批樣品，按照供試品溶液制備方法制備樣品溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液和樣品溶液各10 μL進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算大黃素的含量。結(jié)果批號(hào)為070806，080325，080729的3批樣品中，大黃素平均含量分別為 0.012 7，0.014 1，0.016 8 mg/粒（n=5）。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

有文獻(xiàn)報(bào)道，將大黃素的甲醇溶液置紫外-可見光分光光度計(jì)掃描，結(jié)果大黃素在438，290，253，220 nm波長(zhǎng)處均有吸收峰[1-2]，試驗(yàn)證實(shí)438 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)雜質(zhì)干擾較少，故采用438 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

該制劑中何首烏以水煎提取后投料，所含蒽醌類化合物可溶于甲醇、乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑[3]。若采用氯仿作為溶劑提取大黃素，在本試驗(yàn)條件下檢測(cè)不到大黃素的色譜峰，若用無水乙醇作溶劑則既可減少水溶性雜質(zhì)的干擾，又可充分提取大黃素。故采用無水乙醇作為溶劑提取大黃素。

大黃素可以通過回流[4]和甲醇超聲的方法來提取[5]。筆者對(duì)所考察幾個(gè)批號(hào)的膠囊做了兩種提取方法的對(duì)比試驗(yàn)，取相同量的膠囊內(nèi)容物分別同時(shí)進(jìn)行無水乙醇回流和甲醇超聲（250 mA），時(shí)間均為1 h，此后的操作方法相同。結(jié)果采用甲醇超聲提取的大黃素含量?jī)H為無水乙醇回流提取的30%～60%。故采用無水乙醇回流提取心脈神膠囊中的大黃素。

本文中3個(gè)批次的膠囊中大黃素含量有較大差異。由文獻(xiàn)[6]可知，受產(chǎn)地、生長(zhǎng)年限、采收季節(jié)等因素影響，大黃素含量差異較大，西南地區(qū)何首烏藥材中大黃素的含量為0.004% ～0.41%。根據(jù)心脈神膠囊中何首烏的用量并結(jié)合制備工藝的影響，擬訂心脈神膠囊中大黃素的最低限量為0.012 mg/粒。

[1]丁賢貴，劉麗娜，李勇軍，等.反相高效液相色譜法測(cè)定心腦聯(lián)通膠囊中大黃素的含量[J]. 貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，30（3）：232-234.

[2]羅金樹，譚永恒.HPLC法測(cè)定芩黃喉癥膠囊中大黃素的含量[J].中藥新藥與臨床藥理，2006，17（3）：224-226.

[3]肖崇厚，楊松松，丁林生，等.中藥化學(xué)[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2004：205-206.

[4]瞿發(fā)林，談麗娜，趙 勇.復(fù)方夜靈膠囊中大黃素的含量測(cè)定[J].中國(guó)藥師，2006，9（12）：1 127-1 129.

[5]劉玉紅，王 妮.HPLC測(cè)定大敗毒膠囊中大黃素的含量[J].中醫(yī)藥學(xué)刊，2006，24（5）：936-938.

[6]張 韻，勞三申，唐青華.西南地區(qū)何首烏原藥材的質(zhì)量分析[J].中成藥，1999，21（6）：317-319.