流式細胞術(shù)分析ITP巨核細胞分化發(fā)育異常的初步研究

張海燕,屈晨雪,王建中*,張曉輝,付海霞,汪 潤,袁家穎

(1.北京大學第一醫(yī)院檢驗科,北京100034;2.北京大學人民醫(yī)院 血液科)

特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)是臨床出血性疾病的常見病和多發(fā)病,患者血小板顯著減少,嚴重者出現(xiàn)自發(fā)性出血并可危及生命。最新的研究表明,ITP的發(fā)病不僅與抗血小板自身抗體導致的血小板破壞過多有關(guān),還與自身抗體介導的巨核細胞發(fā)育異常和CD8+T細胞抑制巨核細胞凋亡密切相關(guān)[1]。諸多體外試驗已證實,ITP患者的血漿能明顯抑制巨核細胞的生成和成熟度是導致其血小板生成減少的重要因素[2]。然而,到目前為止,對于ITP患者體內(nèi)骨髓巨核細胞在分化發(fā)育過程中的變化,尤其是對不同DNA倍體巨核細胞功能蛋白表達的研究了解甚少。本研究主要通過建立人骨髓流式巨核細胞分析的臨床實用新方法,初步探討ITP患者巨核細胞在體內(nèi)復雜環(huán)境中數(shù)量與糖蛋白表達水平的變化,進一步闡明ITP的發(fā)病機制,從而為ITP的實驗診斷及治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

15例骨髓移植健康供者作為對照組(NOR),女性5例,男性9例,年齡20-55歲;37例ITP,其中初發(fā)患者29例和治療后未緩解患者8例,男性9例,女性28例,年齡15-81歲。所有病例均符合ITP臨床診斷標準[3];11例繼發(fā)性血小板減少癥(ST組),其中6例白血病骨髓移植后,5例其他病因引起的ST(甲狀腺機能減退癥1例,巨幼細胞性貧血2例,類風濕性關(guān)節(jié)炎1例,再生障礙性貧血1例)。

1.2 儀器和試劑

FACSCalibur流式細胞儀(美國 BD公司);HERMLE-Z383K型離心機(德國HERMLE公司);異硫氰酸熒光素(FITC)標記的抗血管性血友病因子(vWF)多克隆抗體 (美國AbD公司);別藻青蛋白(APC)標記的CD41a單克隆抗體(美國BD公司);FITC標記的抗CD42a單克隆抗體(美國BD公司);APC標記的抗P-選擇素(CD62P)單克隆抗體(美國BD公司);標準微球(CaliBRITE beads)(美國BD公司);碘化丙錠(PI)(美國Sigma公司);Percoll細胞分離液(美國GE公司);透膜液(PERM)(美國BD公司);OLYMPUS顯微鏡等。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 骨髓穿刺液2 ml,加入含EDTA(終濃度為1.5 mg/ml)的抗凝管中。

1.3.2 巨核細胞計數(shù) 取3 μ l抗凝骨髓液涂片,用瑞-姬染液染色,光學顯微鏡低倍鏡下計數(shù)3 μ l骨髓液涂片中全部巨核細胞的數(shù)量,并在油鏡(1000×)下確認。

1.3.3 巨核細胞分離富集 用等滲的Percoll和磷酸鹽緩沖液(PBS)將骨髓中有核細胞數(shù)量調(diào)整至20×106個,并將其Percoll密度調(diào)至1.020 g/mL,將配好的1.020 g/mL骨髓液緩緩加在2 ml密度為1.055 g/ml Percoll分離液上方,然后再加入2 ml PBS,400 g離心20 min,吸取Percoll分離液上面的灰白色細胞層,移至另一個試管中,加1.5倍體積的PBS,300 g離心10 min,棄上清。留取細胞沉淀待用。

1.3.4 巨核細胞的免疫熒光染色 將富集好的巨核細胞懸液用PBS調(diào)成(2-3)×106/ml,加入透膜液 500 μ l,混勻 ,室溫放置 10 min,加入2 mL PBS 450 g,離心 5 min。棄上清。分別加入 CD41a-APC 5 μ l、vWF-FITC 5 μ l、CD62P-APC 5 μ l,混勻 ,室溫下避光 20 min。加2 ml PBS,100 g離心7 min。棄上清。加入RNase 100 μ l,放入37℃水浴箱中孵育30 min。將細胞懸液調(diào)整 500 μ l左右,加入 5 mg/ml PI染色后上流式細胞儀檢測。

1.3.5 流式細胞儀檢測 運用標準微球(CaliBRITE beads)校準流式細胞儀光路、電壓及補償。采用側(cè)向角散射光(SSC)和糖蛋白標記的熒光強度(CD41a-SSC,vWF-SSC)作圖,獲取 500 000-1 000 000個細胞。在CD41a-PI、vWF-PI雙參數(shù)散點圖中,分別以CD41a、vWF陽性信號設(shè)門后分析巨核細胞DNA倍體分布百分率和不同倍體各種糖蛋白的表達水平,后者以相對熒光強度表示蛋白表達量,相對熒光強度為各種糖蛋白表達陽性細胞的熒光強度除以其陰性細胞的熒光強度。

1.4 統(tǒng)計學分析

三組巨核細胞的絕對數(shù)量、巨核細胞DNA倍體百分率、糖蛋白CD41a、vWF、CD62P在各個DNA倍體上的表達量用均數(shù)(ˉx)±標準差(S)表示。采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析,首先進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗;滿足單因素方差分析條件進行單因素方差分析,然后進行Multiple Comparisons LDS兩組之間分析;否則采用多個獨立樣本的非參數(shù)檢驗,然后進行兩個獨立樣本的非參數(shù)檢驗,比較兩組之間的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三組人群靜脈血血小板數(shù)量(PLT)與骨髓涂片巨核細胞的絕對數(shù)量

結(jié)果顯示ITP組和ST組的PLT與對照組相比明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。三組之間骨髓巨核細胞絕對數(shù)量的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),結(jié)果見表1。

表1 三組人群血小板數(shù)量與骨髓巨核細胞絕對數(shù)量比較

2.2 骨髓富集前后巨核細胞DNA倍體比較

富集和未富集的骨髓標本同時標記CD42a-FITC和PI,流式細胞儀分別檢測兩種標本,收獲500 000個細胞,以CD42a-PI雙參數(shù)作圖分析巨核細胞DNA倍體,比較富集前后DNA倍體。結(jié)果顯示未富集標本中巨核細胞少,DNA倍體分布不明顯;富集后巨核細胞比例顯著增多,且倍體分布明顯、清晰。其中1例對照標本未富集時,巨核細胞約占0.06%;富集后巨核細胞占1.02%;增多了17倍。

2.3 兩種標志物分析巨核細胞DNA倍體和蛋白表達量水平比較

以vWF-SSC或CD41a-SSC收獲骨髓巨核細胞,vWF或CD41a陽性設(shè)門R1。以vWF-PI做圖分析巨核細胞(R1)中各倍體的分布百分率,同時分析各倍體的vWF或CD41a的表達量。ITP組分別以vWF和CD41a設(shè)門時,各倍體巨核細胞百分率與對照組無差異(P＞0.05)。ST組以 vWF設(shè)門,在 4N、8N時,DNA倍體百分率高于ITP組和對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。以CD41a設(shè)門,16N時,ST組明顯低于對照組和ITP組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2,表3。

表2 用vWF設(shè)門三組巨核細胞在各個倍體百分率比較

表3 用CD41a設(shè)門三組巨核細胞在各個倍體百分率比較

2.4 巨核細胞CD41a、vWF及CD62P在各倍體巨核細胞的表達水平

對照組骨髓巨核細胞CD41a、vWF、CD62P表達量隨DNA倍體的增加而升高,32N達峰值。ITP組骨髓巨核細胞CD41a表達量在 2N、4N、8N、16N、32N、64N等倍體明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);而與ST組相比,ITP組巨核細胞的CD41a表達量增高,但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。ITP組骨髓巨核細胞的vWF表達量低于對照組,在32N時差異有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。ITP組骨髓巨核細胞的vWF表達量低于對照組,高于ST組,但差異沒有顯著性(P＞0.05),僅在32倍體時的差異有顯著意義(P=0.018)。各倍體巨核細胞CD62P的表達量在三組之間均無顯著性差異(P＞0.05)。三組數(shù)據(jù)比較見表4、表5、表6。

表4 三組人群巨核細胞CD41a表達量比較

表5 三組人群巨核細胞vWF表達量比較

表6 三組人群巨核細胞CD62P表達量比較

3 討論

傳統(tǒng)的ITP發(fā)病機制主要是由于患者體內(nèi)的自身抗體與血小板結(jié)合,導致血小板被單核巨噬細胞系統(tǒng)過度破壞而導致血小板減少。然而,抗體介導的血小板減少并不能解釋所有ITP患者血小板減少的病因:①并非所有ITP患者的血漿/血清能引起正常人血小板減少;②血小板自身抗體只能在50%-70%的ITP患者中檢測到;③部分患者病情的緩解與體內(nèi)抗體的水平無相關(guān)性。這些均提示ITP患者體內(nèi)可能還存在其他引發(fā)血小板減少的機制[1]。

由于巨核細胞在骨髓中所占比例極低(占骨髓有核細胞的0.05%),以前的大多數(shù)文獻報道主要都是用體外培養(yǎng)巨核細胞株的研究。本研究采用Percoll密度梯度離心法富集巨核細胞,克服了巨核細胞數(shù)量少的缺點。結(jié)果顯示富集后巨核細胞數(shù)量增加可達17倍,而且更易看到其多倍體性;未富集標本巨核細胞的數(shù)量較少,倍體分布也不明顯。富集前后相比,DNA倍體分布相似,無明顯的差異[4]。

在ITP患者中,針對CD41a(GPIIb/IIIa)的自身抗體最常見,故試驗中選擇了糖蛋白CD41a和對幼稚巨核細胞更敏感的vWF作為觀察指標[5]。此外標記時,采用透膜后標記CD41a,這樣能同時標記巨核細胞膜表面及胞質(zhì)中CD41a分子,更加全面反映巨核細胞CD41a的合成水平,也排除了在低倍體2N、4N時血小板粘附的影響,使巨核細胞的識別更加特異。

體外研究發(fā)現(xiàn)部分自身抗體陽性ITP患者的血漿的確能抑制巨核細胞生成的數(shù)量和成熟度;骨髓檢查顯示多數(shù)患者骨髓巨核細胞計數(shù)不增多,甚至減少。可能是自身抗體抑制了巨核細胞的生成[6,7]。

正常巨核細胞倍體分布是以16倍體為主,其次是8倍體和32倍體。16N約占50%,大于16N和小于16N的倍體約占50%。本研究對照組的巨核細胞DNA倍體分布基本正常。ITP組巨核細胞的倍體分布與對照組基本相同,各倍體巨核細胞數(shù)量并無差異(P＞0.05)。分析其原因可能是ITP時抗血小板糖蛋白自身抗體與巨核細胞結(jié)合后,僅對巨核細胞蛋白表達產(chǎn)生影響,而對細胞DNA未產(chǎn)生影響,因此DNA倍體分布不發(fā)生偏移[4]。此外,本研究顯示ST組在4N、8N時巨核細胞數(shù)量明顯高于對照組和ITP組(P＜0.05),這可能是因為該組近50%的標本來自白血病骨髓移植后血小板減少,患者幼稚巨核細胞較多,從而造成了4N和8N增多,而16N減少。

CD41a是巨核細胞合成的與血小板聚集功能相關(guān)的糖蛋白,生理狀況下隨著巨核細胞DNA倍體的增加而表達增高。本次試驗中發(fā)現(xiàn):ITP患者各個倍體巨核細胞的CD41a表達規(guī)律與對照組相同,但在巨核細胞發(fā)育的整個階段(2N-64N)中,ITP患者CD41a表達量明顯高于正常人(P＜0.05),其原因可能是ITP時機體產(chǎn)生的抗CD41a的自身抗體使血小板CD41a被單核巨噬細胞系統(tǒng)破壞[8,9],機體為了維持其正常的血小板聚集功能而使巨核細胞合成更多的CD41a,以滿足血小板功能需要。從實驗結(jié)果看這種代償從原始巨核細胞階段開始,貫穿巨核細胞發(fā)育整個過程。因此,可以推測ITP時,骨髓巨核細胞為了代償其功能而發(fā)生糖蛋白CD41a表達的異常。同時ITP患者CD41a表達量也高于ST組,但無顯著性差異(P＞0.05),究其原因可能是由于ST組標本例數(shù)偏少所致無統(tǒng)計學意義;也可能是ST患者巨核細胞也會代償?shù)禺a(chǎn)生更多的CD41a,但是不如ITP那么強。

vWF是血管內(nèi)皮細胞和骨髓巨核細胞合成的一種糖蛋白[10],vWF的表達量在對照組隨著巨核細胞倍體增加而升高,但ITP患者巨核細胞的vWF表達量低于對照組,尤其在高倍體(32N)減低更顯著(P＜0.05)。電鏡檢查發(fā)現(xiàn)ITP時患者骨髓巨核細胞線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹,形成胞質(zhì)內(nèi)空泡增多等[11],可能使巨核細胞質(zhì)中vWF的合成受到影響;由于成熟巨核細胞vWF合成量是不成熟巨核細胞的7.5倍[12],故ITP時高倍體的巨核細胞vWF合成減少更明顯。繼發(fā)性血小板減少癥巨核細胞vWF合成也有降低,可能主要是該組中用一半是骨髓移植后患者,骨髓還處于抑制階段,故vWF合成較少。

CD62P是巨核細胞內(nèi)α顆粒膜糖蛋白,在ITP組各倍體巨核細胞的CD62P表達量與對照組比較并無明顯變化,這與形態(tài)學觀察到的巨核細胞內(nèi)顆粒減少不盡一致。由于CD62P在巨核細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成后被運輸?shù)礁郀柣w中成熟,再跨高爾基體網(wǎng)絡(luò)分類,最后被運輸?shù)溅令w粒[13]。在未成熟的巨核細胞中,CD62P和vWF是共定位的[14],因此兩者在三組人群低倍體巨核細胞的表達均沒統(tǒng)計學意義;而在成熟的巨核細胞中,CD62P和vWF在定位在不同的α顆粒[14],CD62P在三組人群之間沒有統(tǒng)計意義,可能提示CD62P所存在的α顆粒是正常的,或者巨核細胞質(zhì)中CD62P的合成的總量是正常的。vWF在高倍體巨核細胞(32N)中顯著減低,提示ITP時成熟巨核細胞合成vWF的總量減低,或所存在的α顆粒可能存在異常。

綜上所述,本研究建立了流式細胞術(shù)分析人骨髓巨核細胞倍體和糖蛋白表達水平的新方法,并使其有了臨床可用性。同時探討了ITP疾病狀態(tài)下骨髓巨核細胞分化發(fā)育過程中DNA倍體和糖蛋白表達量的變化,表明ITP患者骨髓巨核細胞的數(shù)量和DNA倍體并未受到影響,但功能蛋白的合成卻有顯著變化,尤其是與血小板聚集和粘附功能相關(guān)的糖蛋白CD41a在絕大多數(shù)不同倍體的巨核細胞中合成顯著增高,vWF在高倍體成熟巨核細胞中合成明顯降低,CD62P維持在正常水平,為進一步闡明ITP的發(fā)病機制、診斷與治療等研究提供了重要的實驗依據(jù)。

致謝:北京道培醫(yī)院武平、童春榮大夫,北京大學第一醫(yī)院血液內(nèi)科尹悅大夫為骨髓標本采集提供了幫助,在此一并致謝!

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