蘇木乙醇提取物對坐骨神經損傷小鼠血清髓鞘堿性蛋白含量及神經功能的影響

張 輝,曹 劍,劉 飆,尹維田

(吉林大學中日聯誼醫院手外科,吉林長春130033)

本文應用蘇木乙醇提取物(SME)作用于坐骨神經損傷Balb/c小鼠,擬通過髓鞘堿性蛋白的測定和神經電生理功能評定,研究蘇木乙醇提取物在促進周圍神經再生方面的應用價值。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

健康雄性健康雄性Balb/c小鼠84只,體重18-22 g(吉林大學實驗動物中心),隨機分為蘇木醇提物高中低劑量組及生理鹽水對照組。各按術后3天、5天、1周、2周,4周、8周、12周分為 7個時間點,每個時間點12只。主要試劑:蘇木乙醇提取物(SME)購自陜西昌岳植化技術公司,小鼠髓鞘堿性蛋白(MBP)酶聯免疫分析試劑盒購自Rapidbio公司。

1.2 模型制備與給藥

1%硫噴妥鈉100 mg/kg腹腔麻醉小鼠,術區常規消毒,做右側臀部斜行切口,鈍性分離肌肉,暴露坐骨神經。在坐骨結節下0.5 cm處完全切斷神經干,12倍手術顯微鏡下將斷端對位后以11-0無損傷線吻合斷端兩針,逐層閉合創口。

給藥方法和劑量:采取灌胃方法給藥。參照臨床應用蘇木原藥劑量,等效換算為小鼠灌胃用劑量[5],將此數值作為給藥的中等劑量,并以等比數列量確定高低劑量組用量。最終各組給藥量為,高劑量組16 g/kg/d,中劑量組8 g/kg/d,低劑量組4 g/kg/d,取相應劑量蘇木乙醇提取物以生理鹽水溶解后灌胃。對照組給予同等體積生理鹽水。連續給藥至處死。

1.3 ELISA法測定小鼠髓鞘堿性蛋白(MBP)

按時間點順序,每組取小鼠3只,眼球取血約0.5 ml,于Ep管中常溫靜置2 h后4℃冰箱過夜,次日5 000 r/min離心3 min,取上層血清,儲存于-20℃冰箱備用,待所有動物取材完畢后同時進行ELISA測定。方法嚴格遵照試劑盒說明書。

1.4 神經電生理檢測

應用Medtronic Keypoint肌電/誘發電位儀,4、8、12周時實驗動物雙側坐骨神經均作檢測,主要觀察動作電位波幅(AMP)和運動神經傳導速度(MNCV)的變化。檢測方法:1%硫噴妥鈉腹腔麻醉動物后,無菌消毒術野,俯臥位暴露坐骨神經總干,同芯針電極刺入小鼠比目魚肌肌腹內作為記錄電極,接地電極置于鼠尾部,以平行刺激電極分別于吻合口近側坐骨結節水平及遠側坐骨神經分支處給以超強刺激(電流10 mA),游標卡尺測量并輸入刺激電極間距離,計算得出運動神經傳導速度(MNCV)。室溫控制在24攝氏度。運動神經傳導速度=兩刺激電極間距離/動作電位潛伏期差值(傳導時間)。

1.5 統計學方法

應用SPSS13.0軟件對各時間點數據進行組間 t檢驗,P＜0.05具有顯著性差異。

2 結果

2.1 髓鞘堿性蛋白酶聯免疫分析 標準曲線如圖1。各時間點血清MBP濃度對比結果見表1,高中低劑量組分別與對照組行組間 t檢驗,P＜0.05時存在顯著差異。

圖1 MBP ELISA標準曲線擬合方程為Y=1/(19.050-10.753X0.06)

表1 各時間點動物MBP濃度對比結果

2.2 神經電生理檢測 4、8、12周各時間點電生理檢測結果見表2,高中低劑量組分別與對照組行組間t檢驗,P＜0.05時存在顯著差異。

表2 4、8、12周各時間點電生理檢測結果 P＜0.05存在顯著性差異

3 討論

關于周圍神經損傷后局部免疫反應對神經再生的影響以及應用免疫抑制劑促進周圍神經再生的機制已經有許多相關研究[7-9]。近年的重點則集中于免疫抑制劑FK506,1994年Gold[10]首先報道FK506能提高大鼠坐骨神經擠壓傷后的軸突再生率之后,國內學者在2000年發現在異體手移植術后聯合應用FK506的過程中,移植手的神經生長速度快于同平面自體斷肢再植[11]。此后的一系列研究使FK506促進神經再生的作用得到了普遍的認可[12,13]。

然而FK506造價高昂的同時又不乏免疫抑制類藥物的副作用。本文通過對蘇木乙醇提取物的研究,已經確定了SME對坐骨神經損傷Balb/c小鼠的免疫功能存在顯著的抑制作用,且存在明確的量效關系。本文進一步的研究結果證明,通過抑制損傷后的免疫反應,SME可以降低神經損傷局部的破壞程度,從而加速神經再生。本研究作為一個應用中藥提取物抑制免疫反應促進神經再生的初探,在對之后研究提供實驗基礎的同時也面臨著諸多問題,比如SME促進周圍神經再生的分子生物學機制,對神經元內相關細胞因子表達的干預等,都需要更深入的研究。

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