參一膠囊(Rg3)誘導小鼠黑色素瘤細胞凋亡

孫寶勝,張 矛,劉林林,孫 晶,侯吉光

(1.吉林省腫瘤醫(yī)院放療三科,吉林長春130021;2.吉林大學第二醫(yī)院腫瘤生物治療科;3.吉林大學第二醫(yī)院藥劑科;4.吉林大學第二醫(yī)院放療科)

人參皂苷Rg3是從人參中提取的有效單體成分。研究證明,人參皂苷Rg3可通過抑制腫瘤血管形成,阻斷腫瘤的浸潤和轉移[1,2];提高腫瘤病人免疫力,抑制轉移,并降低腫瘤病人放、化療后毒副作用[3]。本文通過觀察人參皂苷Rg3對黑色素瘤細胞的存活率及細胞凋亡的變化,為其臨床應用提供重要的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

細胞培養(yǎng)液、小牛血清、青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺、胰酶和磷酸鹽緩沖液均購自 Invitrogen公司(Paisley,Scotland,UK)。Taurolidine(Taurolin)溶劑由Geistlich Pharm AG(Wolhusen,Switzerland)贈送。其他的化學試劑均購于sigma-Aldrich公司(St.Louis,MO)。

1.2 細胞及培養(yǎng)

小鼠黑色瘤細胞(B16-4A5)購于美國細胞庫(Manassas,VA)。B16-4A細胞均在含有10%小牛血清、青霉素(100 U·ml-1)和谷氨酰胺(2 mmol·L-1)的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),并在37℃、5%CO2孵箱中貼壁生長。

1.3 細胞增殖活性測定

待B16-4A5細胞生長至指數(shù)期,調細胞濃度為1×105·ml-1。將B16-4A5細胞種植在 96孔培養(yǎng)板(100 μ l·well-1)24 h 后 ,分別給予不同濃度的 taurolidine,并確定最終濃度分別為 0、10、25、50、100 和200 μ mol·L-1。5%的 PVP作為空白對照組。B16-4A5細胞在37℃、CO2孵箱中培養(yǎng)24和48h后,給予100 μ l MTT(5.0g·L-1),37℃繼續(xù)培養(yǎng)3 h,終止培養(yǎng) ,吸去上清,每孔加入150 μ L二甲基亞砜,振蕩 10 min在酶聯(lián)免疫吸附儀上測量各孔光吸收值(CPM)。細胞生長抑制率(%)=(1-實驗組CPM值/對照組CPM 值)×100%。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡

待B16-4A5細胞接近對數(shù)生長期,常規(guī)消化細胞,制成2.5×105·mL-1細胞懸液,接種于 6孔培養(yǎng)板中。24 h后,實驗組給予上述不同濃度的taurolidine。5%的PVP作為空白對照組。B16-4A5細胞在37℃,CO2孵箱中培養(yǎng)24和48 h后,將貼壁及懸浮的細胞離心,收集后震蕩、混勻,在碘化丙啶(PI)混合溶液中(50 mg·L-1PI,3.4 mmol·L-1sodium citrate,1.0 mmol·L-1Tris,0.1 mmol·L-1EDTA,0.1%Triton X-100),并在4℃環(huán)境中避光培養(yǎng)4-6 h。流式細胞儀(BD biosciences,Mountain View,CA)進行檢測,Cell Guest軟件(BD Biosciences)收集并分析結果。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 人參皂苷Rg3對B16-4A5細胞的生長抑制作用

表1是不同濃度人參皂苷Rg3分別作用于B16-4A5細胞24和48 h后,對 B16-4A5細胞增殖能力的影響。從表1可見,人參皂苷Rg3抑制B16-4A5細胞生長是隨時間和劑量而改變的,具有明顯的時效和量效的關系。

表1 不同劑量Rg3對B16-4A5細胞生長抑制率的影響

表2 不同劑量Rg3對B16-4A5細胞凋亡的影響

2.2 人參皂苷Rg3對B16-4A5細胞凋亡的影響

表2是不同濃度人參皂苷Rg3分別作用于B16-4A5細胞24和48 h后凋亡的影響。對照組的B16-4A5細胞在培養(yǎng)48 h后,僅僅產(chǎn)生了小于5%的細胞凋亡;然而,細胞經(jīng)過50μ mol·L-1的人參皂苷Rg3作用后,能夠誘導15%的細胞凋亡,并顯示了明顯的時間和劑量依賴效應(表2)。

3 討論

黑色素瘤作為皮膚癌的一種,其發(fā)病率一直在世界范圍內居高不下[5,6]。由于惡性黑色素瘤細胞很難被化學藥物及輻射誘導凋亡,所以對這些傳統(tǒng)的治療手段具有明顯的抗性。

劉基[4]等研究表明,人參皂苷Rg3對小鼠Lewis肺癌有抑瘤作用,本實驗結果與其相符。結果顯示,人參皂苷Rg3具有明顯的誘導B16-4A5細胞凋亡以及抑制細胞生長的特性,并且顯示了明顯的時間與量效的依賴關系。

[1]趙 翌.20(R)-人參Rg3抗腫瘤作用的研究進展[J].臨床腫瘤學,2001,6(1):81.

[2]明 月,朱玉琢,拱中華,等.人參二醇組皂甙對視網(wǎng)膜色素上皮細胞增生的抑制作用[J].吉林大學學報,2003,2(29):149.

[3]胡笑克,吳利華,胡祖光.薏苡仁酯對鼻咽癌細胞的放射增敏作用[J].中山醫(yī)科大學學報,2000,12(5):234.

[4]劉 基,孫亮新,趙 翌,等.參一膠囊對乳腺癌化療患者免疫扶正Ⅱ期臨床研究[J].中國腫瘤臨床,2000,27:534.

[5]于勇華,陳延條,于金明,等.馬藺子素在食管癌放療中增敏作用的臨床研究[J].中華放射醫(yī)學與防護雜志,1999,19(5):313.

[6]曹棄元,李永強,陳成欣,等.復方丹參、地龍、野木瓜對體外培養(yǎng)的人鼻咽癌細胞的放射增敏作用[J].癌癥,1998,12(2):131.