人臍靜脈內皮細胞分離培養及鑒定技術

吳金義,張 蕾*,張秀英,曲麗梅

(1.吉林大學中日聯誼醫院心內科,吉林長春130033;2.吉林大學基礎醫學院;3.吉林大學第一醫院病理科)

血管內皮細胞是一種多功能細胞,它不僅是血液和組織間物質交換的選擇性通透屏障,而且在造血調控、血管動力學、血管生成、炎癥和免疫應答等許多方面有十分重要的作用[1]。血管內皮細胞是通過合成和分泌多種生物活性皮物質,參與機體多種病理生理過程,并成為動脈粥樣硬化等心血管疾病、炎癥等的靶點。血管內皮細胞損傷或激活產生機能障礙可表現為血管收縮、血壓增高、血栓形成、動脈粥樣硬化及管腔狹窄、閉塞等。因此,成功分離和培養血管內皮細胞,為心腦血管等疾病的研究提供了細胞學基礎。本實驗參考Jaffe法,并進行改進,建立HUVEC體外分離原代培養的方法,并總結對培養的細胞鑒定方法,為多學科多種疾病病理生理機制的研究提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 臍帶:吉林大學第二醫院婦產科;0.25%胰蛋白酶(Difco);血清(武漢大學)M199培養基(GIBCO);IMDM培養基(GIBCO);鼠抗人VIII因子單克隆抗體(Santa Cruz);辣根酶標記的二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 HUVECs分離、培養 本實驗參考Jaffe法,并進行改進,應用胰蛋白酶灌注臍靜脈收集內皮細胞.在無菌條件下于健康產婦分娩后立即取新生兒臍帶,擠出臍帶血管中的血液,放入裝有含青鏈霉素的PBS液瓶中,2 h之內行臍靜脈內皮細胞培養。在無菌條件下取新生兒臍帶,剪去鉗痕和凝血塊阻塞部分,找到臍靜脈。一端插上帶有膠管的玻璃管結扎固定,經膠管接注射器,用生理鹽水灌洗。待臍靜脈內的殘血除凈后,用37℃PBS(0.01 molL,pH7.6),沖洗兩次,將另一端用鐵夾夾閉,向臍靜脈內灌注0.25%胰蛋白酶(Difco)8-10 ml,夾閉膠管放入已滅菌的大平皿中。37℃孵育12 min,在此期間經常翻動臍帶使酶溶液在血管內流動以促使內皮細胞均勻與酶接觸。取出臍帶后輕輕擠壓管壁,將含有內皮細胞的胰蛋白酶注入50 ml錐形離心管中,加入小牛血清2 ml終止酶反應。再以30 ml PBS沖洗管腔,流出液一并入離心管,1 000 r/min離心10 min,棄上清,加入含有10%小牛血清的IMDM(Gibco)培養液,充分混合制成細胞懸液。取0.1ml細胞懸液在血細胞計數板計數。最后調細胞數,以1×105/ml接種至24孔培養板中,每孔1ml。置于 5%CO2,37℃靜止培養24 h更換培養液,以除去未貼壁的細胞。以后每隔2 d換液1次,以維持細胞的營養和內環境的穩定。

1.2.2 HUVECs傳代 原代內皮細胞融合后用培養液沖洗兩次,然后用0.25%胰酶和0.25%ETDA1∶1充分混勻后加入到內皮細胞中,每孔0.3 ml。邊消化邊在倒置顯微鏡下觀察。細胞皺縮、彼此分離或呈大片狀分離即可終止消化。加入含有10%小牛血清的培養液,吸管吹打,制成細胞懸液,計數后按105個細胞/ml,繼續培養。

1.2.3 培養HUVECs的三種方法鑒定 本實驗應用Olympus倒置顯微鏡對細胞形態及生長情況進行觀察;透射電鏡下觀察培養的內皮細胞超微結構的透射電鏡觀察;人臍靜脈內皮細胞第VIII因子相關抗原的SP免疫組織化學染色法檢測相關抗原。

2 結果

2.1 形態學觀察 培養過程中用Olympus倒置顯微鏡對細胞形態及生長情況進行觀察(如圖1)。早期細胞呈小多角、球形、呈團狀,少數細胞伸展,24 h后可見細胞貼壁,48-72 h生長最快,逐漸生長成梭形,有些細胞排列呈魚貫狀相連,間有旋禍狀排列。核清晰,呈圓形或橢圓形,核分裂相多見,1-2核仁,胞漿豐富。于3-4 d后融合,7-10 d胞體呈多角形,相互嵌合,為單層呈鋪路石狀排列。

圖1 HUVECs形態觀察:單層鋪路石樣排列

2.2 人臍靜脈內皮細胞超微結構的透射電鏡觀察

透射電鏡下觀察培養的內皮細胞,可見細胞呈多角形,表面有胞漿突起形成的細絨毛。有較多的胞漿空泡,有豐富的線粒體、核糖體、粗面內質網、高爾基復合體及溶酶體。胞漿內還有作用為人內皮細胞特征性標志的Weibel-Palade小體(W-P小體),其橫切面呈圓形或橢圓形,縱切面呈桿狀,均可見小管狀結構(圖2)。

圖2 HUVECs超微結構,典型 Weibel-Palade小體

2.3 內皮細胞中人第VIII因子相關抗原的檢測[2]

人臍靜脈內皮細胞第VIII因子相關抗原的SP免疫組織化學染色法可見細胞呈圓形、梭形或多邊形,胞漿豐富,并有棕黃色的染色顆粒,即為陽性反應,證實培養的細胞為內皮細胞。對照組細胞為陰性結果 。(圖 3)

2.4 HUVECs各階段生長狀況(圖4-6)

圖3 FⅧAg強陽性

圖4 第2天臍靜脈內皮細胞培養結果

3 討論

圖5 第4天臍靜脈內皮細胞培養結果

圖6 第7天臍靜脈內皮細胞培養結果

人臍靜脈作為培養血管內皮細胞的來源,是因為它具有取材、操作方便,技術較成熟,獲得細胞數多,為心腦血管疾病病理生理機制的研究提供了方便。在培養細胞的獲取方法上,有機械刮取、組織塊移植和酶消化法三種。機械刮取法即將臍靜脈沿縱軸剪開,用消毒手術刀背等刮取ECs,發現這一種方法不是因為刮得太輕取得的細胞數太少,就是過度刮取導致含有較多其它非內皮細胞成分,需進一步純化,或損傷細胞,導致存活率不高。灌注消化法因為消化時間難于掌握,不是因為消化時間過短取得的細胞數太少,就是消化過度致使細胞存活率低,因此,這兩種方法均難于獲得滿意效果[3]?，F在大多數學者在研究中應用胰蛋白酶灌注臍靜脈收集內皮細胞,接種后很快貼壁生長。我們經過多次實驗比較,以0.25%的胰酶、作用8 min及溫度為37℃為最佳條件。如果溫度過高,時間過長都會增加纖維母細胞和平滑肌細胞脫落混入內皮細胞以及內皮細胞成活率低。取材要新鮮,保存時間以6 h之內為好,超過6 h時間會使細胞存活率降低。有研究表明[4]人臍帶靜脈離體后,隨著時間的延長,內皮細胞某些物質的含量會發生變化,離體超過6 h,內皮細胞Ⅷ因子相關抗原釋放量以及前列環素生成量均隨放置時間延長而呈下降超勢,變化顯著,且臍帶離體時間與細胞成活率是負相關。培養液的pH值是影響細胞生長的因素之一,內皮細胞生長的最適pH值為7.2-7.4,初期培養液的pH值宜稍低(pH7.0左右),這樣細胞易貼壁和生長。培養液中需加一定濃度的血清。原因可能是血液在凝固過程中血小板聚集時所釋放的各種因子有刺激內皮細胞生長的作用,尤其是血小板能夠釋放一種血小板衍生因子,促進內皮細胞的生長繁殖。血清的質量也很重要,培養液用于培養細胞時,必須附加一定量的血清,否則細胞貼壁伸展能力較弱,貼壁細胞繁殖速度慢,且以后多懸浮、死亡,我們的經驗是進口胎牛血清培養的細胞成長好,成功率高。關于內皮細胞的鑒定,WebelER等在1964年研究發現動脈內皮細胞漿中有桿狀多管小體,Jaffe和Gimbrene等提出內皮細胞鑒定法的根據是:①相差顯微鏡下,細胞呈多角形,單層鋪路石狀排列,或短梭形細胞呈魚貫樣排列。②熒光抗體法證明胞漿中有VWF因子。③透射電鏡下,胞漿內有Weibel-palade小體。結果符合上述鑒定標準,可確定為內皮細胞。Jaffe[5]進一步研究認為VWF相關抗原免疫熒光檢測最為可靠,因為在人體內,除內皮細胞外,僅在血小板和巨核細胞中存在因子VWF相關抗原,故可與血管平滑肌和成纖維細胞相鑒別。至于Weibel-palabe小體在胞漿中檢出,固然對內皮細胞鑒定具有特異性,但并非每個細胞皆能檢出,故意義不大。總之,我們綜合了上述多個學者的經驗成功培養出臍靜脈內皮細胞并進行多個鑒定方法的嘗試,為血管內皮細胞的研究提供了實驗模型。最新研究發現[6],血管內皮細胞生長因子和堿性成纖維細胞生長因子等有助于培養的胚胎干細胞分化為內皮細胞,胚胎干細胞有望成為新的種子細胞來源。

[1]Oruckaptan HH,Senmevsim O,Ozcan OE,et al.Pituitary adenomas results of 684 surgically treated patients and review of the literature[J].Surg Neurol,2000,53(3):211.

[2]李孟彬,王為忠,張宏偉,等.豬血管內皮細胞的培養與表型鑒定[J].第四軍醫大學學報,2004,25(24):45.

[3]Gomez DE,Alonso DF,Yoshiji H,etal.Tissue inhibitors of metal-proteinases structure,regulation and biological functions[J].Eur J Cell Boil,1997,74:111.

[4]王建民,劉萌秋,賴西南.正常臍靜脈離體后不同時間內某些物質含量的變化[J].第三軍醫大學學報,1995,17:86.

[5]Jaffe EA.Synthesis of antibemophilic factor antigen by cultured humanendothelialcells[J].J Clin Invest,1973,52:2757.

[6]Savore C,Zhang C,MuirC,et al.Perlecan Knockdown inmetastatic prostate cancer cells reduces heparin-binding growth factor responses in vitro and tumor growth in vivo[J].Clin ExpMetastasis,2005,22(5):377.