Cyclopamine對人前列腺癌PC-3細胞增殖凋亡及Bcl-2,Bax,caspase-9蛋白表達的影響

李潤軍,郝曉蕊,湯秀英,張志耀,孫志新,張宏生,佟 明

(1.河北省秦皇島港務集團有限公司港口醫(yī)院泌尿外科,河北秦皇島,066000;2.河北省秦皇島市第一醫(yī)院CCU,河北秦皇島,066000;3.遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院泌尿外科,遼寧錦州,121001)

近年來我國前列腺癌(PCa)發(fā)病率的增長極為迅速,而晚期前列腺癌的治療至今未取得重大進展。研究顯示Hedgehog(Hh)信號通路在晚期前列腺癌中起到重要作用[1-3],Hh信號通路異常激活時,還會引起其它多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Cyclopamine是一種甾族生物堿,從百花科類植物中提取,主要通過對抗 Hh下游分子Smoothed(Smo),可以使Smo的空間構(gòu)象發(fā)生改變,抑制Smo的活性從而特異性抑制Hh信號通路。Cyclopamine目前也沒有它在其他哺乳類動物中有毒害作用的證據(jù),提示cyclopamine可能是一類很有前景的抗腫瘤藥物[4]。而最近一些實驗研究顯示體外培養(yǎng)的常見前列腺癌細胞系無Hh信號通路異常激活[5-6],考慮cyclopamine抑制前列腺癌細胞增殖是通過非特異性作用于Hh信號通路或因細胞毒性效應[5],而Zhang X等[7]的實驗研究結(jié)果表明cyclopamine對癌細胞的作用與抑制Smo活性無關,故cyclopamine作用于癌細胞的確切機制尚不清楚,本實驗通過cyclopamine對人前列腺癌PC-3細胞體外增殖抑制,誘導其凋亡及對Bcl-2,Bax,caspase-9蛋白表達變化的影響,來初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株與試劑

人前列腺癌PC-3細胞購自中國科學院上海細胞庫。Cyclopamine購自美國Biomol International公司,二甲基亞砜(DMSO),胰蛋白酶購自美國Sigma公司,F12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司,胎牛血清購自德國 Biochrom公司,噻唑藍(MTT)購自北京拜爾迪生物技術公司,Annexin—V凋亡試劑盒購自北京寶賽生物技術公司,兔抗Bcl-2,Bax,caspase-9多克隆抗體均購自Santa Cruz生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):將PC-3細胞培養(yǎng)于含有F12培養(yǎng)液90%,胎牛血清10%,青鏈霉素各100 U/ml培養(yǎng)基中,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。2～3 d換液1次,3～5 d用2.5 g/L的胰蛋白酶消化傳代1次,取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2 MTT實驗:將 PC-3細胞以 5×103/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中,100 μ L/孔,每個濃度設4個復孔,并設對照組,對照組是不加處理因素,每天更換F12培養(yǎng)基;置于37℃ 、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h;待細胞貼壁后,加入不同終濃度 cyclopamine 溶液(1、4、8 、12 μ mol/L),分別培養(yǎng)24,48,72,96,120 h;終止培養(yǎng)前4 h每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μ L,繼續(xù)培養(yǎng),終止時吸棄上清液,每孔加入 100 μ L DMSO,微孔板震蕩器上震蕩10 min,酶標儀570 nm波長處測定各孔吸光度值(OD),在不同濃度藥物作用下,細胞生長的抑制率(%)=1-(實驗組平均OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.3 透射電鏡下對凋亡細胞超微結(jié)構(gòu)觀察:將PC-3胞懸液5×106個接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中,濃度為12 μ mol/L的 cyclopamine處理PC-3細胞72 h后,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌待檢細胞,再加入3%戊二醛4℃放置10 min,然后離心,接著按照透射電鏡的常規(guī)方法制片:前固定,清洗,后固定,脫水,浸透,包埋,聚合,修塊,制備成超薄切片,透射電鏡下觀察。

1.2.4 流式細胞儀測定細胞凋亡率:將PC-3細胞懸液 1×106個接種于 6孔板中;設立 cyclopamine為3個藥物濃度:4,8,12 μ mol/L,及對照組。對照組是不加處理因素,每天更換F12培養(yǎng)基,共4組細胞,置于 37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,進入對數(shù)生長期后將培養(yǎng)液吸棄加藥,作用于細胞繼續(xù)培養(yǎng)72 h;收集貼壁及懸浮細胞,1 000 r/min,離心 5 min,棄上清液;加入新鮮配制PBS(pH=7.4)3 mL洗2次,1 000 r/min,離心5 min;棄上清液,將細胞重懸于200 μ L Binding Buffer;加入 10 μ L Annexin V-FITC和5 μ L PI,輕輕混勻,避光室溫反應 15 min,加入300 μ L Binding Buffer,1 h內(nèi)在流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5 Western印跡技術:將PC-3細胞分瓶并置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。加藥處理(分組和加藥方法同上),作用于細胞溫育72 h后,收集細胞,PBS洗滌細胞,加細胞裂解液,超聲破碎細胞,Lowry法測定蛋白濃度。SDSPAGE凝膠電泳分離細胞總蛋白,將蛋白通過電轉(zhuǎn)移印跡到PVDF膜上,5%牛血清白蛋白/PBS液封閉PVDF膜;蛋白上樣量分別為50 μ g,一抗?jié)舛葹?∶500,辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗(二抗?jié)舛纫矠?∶500)結(jié)合,ECL試劑發(fā)光,X膠片曝光,顯影,定影,將條帶掃描后灰度分析。

2 實驗結(jié)果

2.1 MTT法實驗結(jié)果

檢測不同濃度的cyclopamine作用不同時間對PC-3細胞增殖的影響(圖1),結(jié)果顯示1 μ mol/L組對PC-3細胞無明顯增殖抑制作用,與對照組相比差異無顯著性(P>0.05)。4 μ mol/L 組 ,8 μ mol/L 組及 12 μ mol/L 組對 PC-3細胞增殖有顯著抑制作用,抑制效果都隨著濃度增大,時間的增加而增強,與對照組相比差異有顯著性(P<0.05或 P<0.01),其中 8 μ mol/L組于72 h達到IC50。

圖1 Cyclopamine作用PC-3細胞后對增殖的影響實驗組與對照組相比較:＊P<0.05,＊＊P<0.01

2.2 透射電子顯微鏡觀察結(jié)果

12 μ mol/L濃度的cyclopamine溶液處理PC-3細胞72 h后見細胞體積縮小,細胞變圓,胞膜皺縮,邊緣毛糙,形成不規(guī)則突起,胞漿內(nèi)見凋亡小體及增多的空泡,細胞核染色質(zhì)發(fā)生邊集,固縮,在細胞核膜周邊聚集形成新月體形或花瓣形,電子密度增強(圖2)。

圖2 12 μ mol/L濃度的cyclopamine作用72 h后PC-3細胞發(fā)生凋亡電鏡超微結(jié)構(gòu)圖(×5 000)

2.3 流式細胞儀分析結(jié)果

使用AV-PI雙染法后經(jīng)流式細胞儀測定了不同 濃 度 cyclopamine(4 μ mol/L,8 μ mol/L,12μ mol/L)作用PC-3細胞72 h后細胞的凋亡率分別為(8.19±1.58)%、(29.50±3.21)%、(40.78±4.67)%,對照組的細胞凋亡率(3.27±0.35)%,結(jié)果說明cyclopamine對PC-3細胞有誘導其凋亡作用,各實驗組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),且細胞凋亡率隨著cyclopamine濃度增大而增加(圖3)。

2.4 Western印跡技術檢測結(jié)果

不同濃度 cyclopamine(4 μ mol/L,8 μ mol/L,12 μ mol/L)處理細胞72 h后,隨著藥物濃度逐漸增加,Bcl-2蛋白表達逐漸減少,而Bax,激活的casapse-9(Cleaved casapse-9)蛋白表達逐漸增強,而內(nèi)參β-actin蛋白表達無明顯變化(圖4)。

3 討 論

圖3 不同濃度cyclopamine作用PC-3細胞72 h后細胞凋亡散點圖

圖4 不同濃度cyclopamine作用PC-3細胞72 h后Bcl-2,Bax及caspase-9蛋白表達變化

Hedgehog信號通路,在早期胚胎多器官系統(tǒng)的正常發(fā)育過程中起到關鍵作用,而持續(xù)的Hh通路刺激可誘發(fā)20%～25%人類腫瘤。在哺乳動物中有3種Hh同源物,分別是Sonic Hedgehog(Shh)、Indian Hedgehog(Ihh)、Desert Hedgehog(Dhh)。Hh信號的接收和傳導由位于靶細胞膜上的Patched(Ptch)和 Smoothened(Smo)組成的復合物控制。Ptch是Hh的受體,在正常情況下,Ptch與Smo組成復合物,抑制了Smo的信號活性,從而抑制下游通路。當Ptc和Hh結(jié)合以后,解除Ptch對Smo的抑制作用,從而使Smo活化,促使下游通路轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白與蛋白激酶A(PKA)及一些未知因子與微管形成大分子復合物,使得全長Gli蛋白進入核內(nèi)激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄[8]。Hh信號通路與很多已知調(diào)控細胞分化增殖的Notch,Wnt,Ras-Erk,生長因子等信號通路之間有交叉作用。一些研究顯示,Hh信號通路與前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關[1-3]。而cyclopamine作為Hh信號通路特異性抑制劑作用于該通路中的Smo,特異性抑制Hh信號通路,抑制了體外培養(yǎng)的人類前列腺癌細胞的增殖[1-3]和異種移植于鼠體的前列腺癌的生長[1,9],從而治療前列腺癌取得了顯著的效果。最近一些實驗研究顯示體外培養(yǎng)的常見前列腺癌細胞系無Hh信號通路異常激活[5-6],故cyclopamine作用于癌細胞可能有其他的機制,而確切機制仍尚不清楚。有研究表明,cyclopamine作用于PC-3細胞增加P-27蛋白表達水平,抑制胰島素樣生長因子-II(IGF-II)的表達和Akt的激活[10]。Cyclopamine誘導人胃癌細胞凋亡可下調(diào)Bcl-2蛋白表達,激活casapse-9的表達[11]。本研究是cyclopamine誘導人前列腺癌PC-3細胞凋亡在線粒體途徑引起B(yǎng)cl-2,Bax及caspase-9蛋白表達的變化對其機制做初步探討。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),cyclopamine有抑制PC-3細胞增殖的作用。1 μ mol/L濃度組對PC-3細胞無明顯增殖抑制作用,4 μ mol/L組,8 μ mol/L及12 μ mol/L組對PC-3細胞增殖有顯著抑制作用,三者抑制效果都隨著時間的增加而增強,表明在一定劑量和時間范圍內(nèi)呈時間-濃度依賴關系。而透射電鏡下可觀察到PC-3細胞凋亡后超微結(jié)構(gòu)變化,呈典型的凋亡樣改變。作者使用AV-PI雙染法后經(jīng)流式細胞儀測定了 4 μ mol/L組,8 μ mol/L及12 μ mol/L組作用 PC-3細胞 72 h后細胞的凋亡率,結(jié)果說明cyclopamine對PC-3細胞有誘導其凋亡作用,且細胞凋亡率隨著 cyclopamine濃度增大而增加,表明呈濃度依賴關系。

細胞凋亡是一個復雜的過程,主要包括兩大執(zhí)行途徑,即線粒體途徑和死亡受體途徑。線粒體途徑它可使細胞色素C從線粒體中釋放至胞漿中,從而激活caspase-9,一旦caspase-9被激活,即激活下游的效應caspase,從而誘導細胞凋亡。Bcl-2家族是線粒體途徑凋亡過程中主要的調(diào)控因子,該家族成員可以調(diào)節(jié)細胞色素的釋放同時也可直接或間接激活caspase。Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白(anti-apoptotic proteins),如Bcl-2,Bcl-Xl,Mcl-1,Bfl-1,Bcl-W,Bcl-G等,促凋亡蛋白(pro-apoptotic proteins),如Bax,Bak,Bok,Bad,Bid,Bik,Bim等[12]。抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax間的比例在維持體內(nèi)平衡中起重要作用,Bcl-2蛋白表達占優(yōu)勢時可使細胞免遭凋亡。反之,Bax蛋白表達占優(yōu)勢時則促進細胞凋亡。本研究顯示cyclopamine作用于PC-3細胞72 h后,Bcl-2蛋白表達逐漸減少,同時Bax蛋白表達逐漸增強,因此使Bax/Bcl-2比值顯著增高,有利于促進細胞凋亡。相應的,隨著藥物濃度逐漸增加,激活的casapse-9(Cleaved casapse-9)蛋白表達也逐漸增強。本研究證實了cyclopamine有抑制PC-3細胞增殖,誘導其凋亡作用,并通過線粒體途徑下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2和上調(diào)促凋亡蛋白Bax表達,激活casapse-9的表達,從而激活下游的效應caspase,促使細胞凋亡,這可能是其作用機制之一。而cyclopamine是細胞毒效應還是作用于其他信號通路而誘發(fā)細胞在線粒體途徑凋亡引起B(yǎng)cl-2,Bax,casapse-9蛋白表達改變尚不明確,cyclopamine誘導前列腺癌細胞凋亡的機制等還有待于進一步研究。

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