人肝素酶蛋白的表達及其單克隆抗體的制備

師紅磊,陳 偉,李 寧,湯旭東,余松濤,王 健,楊仕明

(1.第三軍醫大學西南醫院全軍消化病研究所,2.第三軍醫大學西南醫院放射科,重慶,400038)

肝素酶(heparanase,HPA)是1999年由四個不同的實驗室克隆成功的一種腫瘤轉移相關基因[1],為內源β-D-葡萄糖醛酸酶,定位于溶酶體和高爾基體,在腫瘤血管生成、腫瘤生長、浸潤和0轉移中起重要作用。其生物學功能主要包括:降解基底膜(BM)和細胞外基質(ECM)的主要成分——硫酸乙酰肝素多糖鏈(HSPGs),破壞細胞微環境的屏障,促進腫瘤浸潤和轉移[2];釋放和激活結合在HSPGs上的生物因子,使其與腫瘤細胞表面受體結合,刺激細胞增生、抗凋亡以及血管生成等惡性轉化特質[3]。大量的臨床研究表明,在大多數人類腫瘤細胞中肝素酶的表達水平升高,其表達水平的高低與腫瘤的轉移潛能及預后相關[4-8]。HPA越來越被人們重視,有關HPA抗體國外已多家生物公司有售,但價格相對昂貴。本研究的目的在于制備基于HPA全長氨基酸序列的單克隆抗體,為下一步基于HPA單克隆抗體的腫瘤分子顯像研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料菌種、質粒:所用菌株E coli BL21(DE3)、DH5α、SP2/0細胞為本實驗室保存;pET30a(+)購自Novagen公司;pcDNA3-HPA為我室構建;Balb/c小鼠來自第三軍醫大學動物中心。

1.1.2 試劑:限制性內切酶,ExTaq酶(TaKaRa公司);T4DNA連接酶,膠回收試劑盒(美國Promega公司);質粒小提試劑盒(美國Omega公司);DNA Marker(上海生工);胎牛血清(美國Hyclone);弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑(Sigma公司);克隆抗體亞類鑒定試劑盒(SIGMA公司);HRP標記的羊抗兔購自北京中杉金橋生物技術有限公司;純化所用層析柱及填料購自Amersham公司;其它試劑均為分析純;實驗用水為去離子雙蒸水。

1.2 方法

1.2.1 人肝素酶重組表達載體的構建:從NCBI GenBank提供的人肝素酶cDNA序列設計PCR引 物。 正 向 引 物:5′CGGAATTCGGTGGTGGTCAGGACGTCGTGGACCTG 3′;反向引物 :5′CCGCTCGAGTCAGATGCAAGCAGCAAC TTTG 3′,劃線部分為EcoR Ⅰ和XhoⅠ酶切位點。以載有肝素酶 cDNA全長的pcDNA3質粒載體為模板進行PCR,退火溫度選擇在60℃,30個循環,擴增產物經 EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切后,連接至pET-30a(+)原核表達載體多克隆位點上,連接產物轉化DH5α感受態中,EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切的方法鑒定重組質粒,陽性重組質粒再進行測序測定。

1.2.2 人重組肝素酶融合蛋白的表達:測序驗證正確的質粒轉化E.coli BL21(DE3)感受態中,按常規IPTG誘導表達,6 000 r/min離心3 min收集菌體,用超聲破菌儀裂解菌體并高速離心分離細菌上清和沉淀,15%SDS-PAGE電泳鑒定其可溶性情況。

1.2.3 人肝素酶融合蛋白純化及質譜分析:經表達條件優化后進行大量誘導蛋白,分離包涵體溶于含有8 M尿素的His-Binding buffer(20 mmol/L Na2HPO4,0.5 mol/L NaCl,pH 7.4),充分溶解后上Ni柱純化,采用含8 mol/L尿素的His-E-lution buffer(20 mmol/L Na2HPO4,0.5 mol/L NaCl,500 mmol/L咪唑,pH 7.4),分別收集穿透及洗脫蛋白,15%SDS-PAGE電泳進行鑒定。電泳鑒定后將純化做質譜分析,純化產物用BCA法蛋白定量。

1.2.4 人肝素酶蛋白單克隆抗體制備:將純化的人肝素酶重組蛋白從用pH 7.4的 0.01 mol/L PBS將其稀釋到0.6 mg/mL,與等體積弗氏完全佐劑混合后采用雙注射器互推法乳化抗原。免疫程序:首次免疫,60 μ g/只(0.1 mL)人肝素酶重組蛋白+等體積弗氏完全佐劑,皮內多點加腹腔注射;第3天采用與第1次相同的佐劑及劑量沖擊免疫和第28天進行第3次免疫,佐劑改為弗氏不完全佐劑,抗原量、注射體積及途徑不變;之后每4周1次腹腔加強免疫,第4～5次免疫后間接ELISA法測定效價,細胞融合前3天進行加強免疫。取達到高效價的免疫小鼠脾臟與SP2/0細胞融合,10 d后間接ELISA篩選陽性克隆,并采用其它相關蛋白排除抗標簽蛋白及菌體蛋白的克隆,數次克隆化后凍存,并采用腹水法大量制備抗體。

1.2.5 小鼠腹水制備單克隆抗體并純化及鑒定:選用健康雌性Balb/c小鼠10只,腹腔注射0.5mL石蠟油/鼠,1-2周后腹腔注射雜交瘤細胞106/鼠;等小鼠明顯產生腹水后拉頸處死,用吸管從腹腔取出腹水。制備的腹水經二氧化硅去除脂質后用HiTrap rProtein A HP純化抗體,純化的抗體用SIGMA亞類試劑盒測定其亞類,并用競爭ELISA測定相對親和力。Lowry法測定抗體濃度,將抗體分裝冷凍保存。

2 結 果

2.1 人肝素酶蛋白編碼序列的擴增

對PCR產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳,可見大小約1 600 bp的產物,與人肝素酶蛋白編碼序列1 527 bp長度相符(圖1),EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切連接至pET-30a(+),提取質粒雙酶切鑒定陽性克隆質粒經測序完全正確。

圖1 人肝素酶蛋白擴增反應產物的瓊脂糖凝膠電泳

2.2 人肝素酶融合蛋白的表達

經測序驗證的pET-30a(+)-HPA質粒轉化入表達宿主BL21(DE3),經1.0 mmol/L IPTG 37℃誘導表達5 h。電泳結果表明pET-30a(+)-HPA在BL21中表達融合蛋白,分子量為63 KD左右,表達量占菌體總蛋白的10%以上。經鑒定表達蛋白破菌后幾乎都存在于沉淀中,為包涵體表達(圖2)。

圖2 重組人肝素酶誘導表達

2.3 人肝素酶融合蛋白純化及質譜分析

大量表達分離的包涵體溶于含有8 mol/L尿素緩沖液經 Ni柱純化后,純化后的純度約為90%,結果見(圖3)。由于純化后始終由兩條小的片斷除不去,1個片段在48 kD左右,1個片斷在45 kD左右,送片斷做質譜分析,結果表明兩個小片段也是人類肝素酶蛋白。BCA法蛋白定量濃度為9 g/L。

2.4 人肝素酶蛋白單克隆抗體制備

使用重組人肝素酶蛋白包被ELISA板,間接ELISA篩選出強陽性克隆 24孔,進一步使用pET-30a(+)空質粒誘導菌破菌蛋白以及相同質粒重組CGRP蛋白為對照,篩選人肝素酶蛋白特異性抗體15株。經四次克隆化后10株抗體達到100%陽性,能穩定分泌抗體,準備大量制備腹水純化抗體。

圖3 人肝素酶融合蛋白Ni柱純化結果

2.5 小鼠腹水制備單克隆抗體并純化及鑒定

制備的腹水經二氧化硅去除脂質后用Hi-Trap rProtein A HP純化抗體,純化的抗體用SIGMA亞類試劑盒測定其亞類,10株抗體有8株IgG和兩株IgM,經競爭ELISA測定相對親和力結果如下(表1),綜合親和力及亞類最終確定1B11、3H11、4H8進一步鑒定。

表1 10株單抗的亞類及親和力的測定

2.6 抗人肝素酶單克隆抗體的特異性鑒定

ELISA法檢測抗體特異性經測定結果如下(圖 4),3株 IgG 抗體(1B11、3H11、4H8)均為抗重組人肝素酶蛋白,均不與相同載體及宿主菌誘導上清反應,同時不與相同表達方式的無關重組GST蛋白反應,初步可以確定為人肝素酶蛋白特異性抗體,進一步Western blotting鑒定(圖5),抗體均為抗重組人肝素酶蛋白,均不與相同載體及宿主菌誘導上清反應,結果與 ELISA鑒定一致。

3 討 論

圖4 ELISA法檢測抗體特異性

圖5 Western blotting鑒定抗體特異性

本研究主要涉及人肝素酶蛋白的原核表達、純化及其單克隆抗體的制備、純化和鑒定。通過將人肝素酶蛋白編碼序列克隆入pET30-a(+)原核表達載體,再將重組載體轉化大腸桿菌BL21,經IPTG誘導,取所得菌體裂解液上清,經鎳柱純化,獲得較高純度的人肝素酶融合蛋白,證實了在大腸桿菌原核表達系統中表達并獲得高純度人肝素酶融合蛋白的可行性,同時用雜交瘤技術,免疫制備了10株穩定分泌人肝素酶單抗的雜交瘤細胞株,通過親和純化獲得人肝素酶單克隆抗體,為腫瘤早期轉移的MRI分子顯像研究奠定了基礎。

長期的研究表明,肝素酶在胚胎時期神經、血管發育過程中起重要作用,在病理情況下參與機體的創傷修復、血管重建和免疫監視等過程[9-11]。其作為一種新型的促腫瘤因子,以特有的酶解活性和非酶解活性通過多個環節、多個渠道促進腫瘤的發生、發展和轉移。探討肝素酶在腫瘤中表達調控機制,力求從上游抑制肝素酶的表達和活性,已成為治療惡性腫瘤的新型策略之一。因此作者制備具有人肝素酶免疫識別性的雜交瘤細胞株,這為進一步研究人肝素酶在惡性腫瘤轉移的診斷以及抗體介導的靶向治療奠定了基礎。

[1]Hulett M D,Freeman C,Hamdorf B J,et al.Cloning of mammalian heparanase,an important enzyme in tumor invasion and metastasis[J].Nat Med,1999,5:803.

[2]Ilan N,Elkin M,Vlodavsky I.Regulation,function and clinical significance of heparanase in cancer metastasis and angiogenesis[J].Int J Biochem Cell Biol,2006,38(12):2018.

[3]Boyd D D,Nakajima M.Involvement of heparanase in tumor metastases:a new target in cancer therapy[J].J Natl Cancer Inst,2004,96(16):1194.

[4]Cohen I,Pappo O,EIkin M,et al.Heparanase promotes growth,angiogenesis and survival of primary breast tumors[J].Int J Cancer,2006,118(7):1609.

[5]蔡永國,房殿春,楊仕明,等.肝素酶mRNA在胃癌組織中的表達及其與 c-met表達的關系[J].中華醫學雜志,2004,84(12):974.

[6]Fjeldstad K,Kolset S O.Decreasing the metastatic potential in cancers-targeting the heparin sulfate proteoglycans[J].Curr Drug Targets,2005,6(6):665.

[7]Nobuhisa T,Naomoto Y,Ohkawa T,et al.Heparaanase expression correlates with malignant potential in human colon cancer[J].J Cancer Res Clin Oncol,2005,131(4):229.

[8]Sanderson R D,Yang Y,Kelly T,et al.Enzymatic remodeling of heparin sulfate proteoglycans within the tumor microenvironment:growth regulation and the prospect of new cancer therapies[J].J Cell Biochem,2005,96(5):897.

[9]Nathan S.Ihrcke,William Parker,Kathryn J.Reissner,et al.Regulation of platelet hepraranase during inflammation:Role of pH and proteinases[J].Journal of Cellular Physiology,1998,175(3):255.

[10]Goldshmidt O,Zeharia E,Aingorn H,et al.Expression pattern and secretion of human and chicken heparanase are determined by their signal peptide sequence[J].J Biol Chem,2001,276(31):29178.

[11]Rachel W.Li,Craig Freeman,Di Yu,et al.Hindmarsh,Kathleen E.Tymms,Christopher R.Parish,Paul N.Smith.Dramatic regulation of heparanase activity and angiogenesis gene expression in synovium from patients with rheumatoid arthritis[J].Arthritis&Rheumatism,2008,58(6):1590.