端粒酶hTERT促進腫瘤細胞侵襲與轉移及其機制研究

陳 陵,余松濤,梁光萍,湯旭東,房殿春,楊仕明

(1.第三軍醫大學西南醫院全軍消化病研究所,重慶,400038;2.第三軍醫大學西南醫院全軍燒傷研究所,重慶,400038)

在永生化細胞及癌細胞中,端粒長度維持的主要機制是端粒酶激活。端粒酶能以自身RNA為模板,延長后隨鏈模板的3′端,從而避免了由于不完全復制而導致的染色體DNA縮短[1]。因此,端粒酶有可能成為抗腫瘤治療的理想靶位。目前以端粒酶為靶點的抗腫瘤治療已成為研究熱點,并且在實驗及早期臨床試驗中取得一定效果[2-3]。但對于以旁路途徑(ALT,alternative lengthening of telomeres)延長端粒的腫瘤而言,以端粒酶為靶點的抗腫瘤治療顯然無效[4]。另外,以端粒酶為靶點的抗腫瘤治療對腫瘤細胞的篩選壓力是否會誘導或產生ALT途徑的激活,目前也日益受到關注[5]。因此,對ALT與端粒酶途徑機制及相互關系的研究顯得異常重要[6]。Stewart等[7]發現hTERT轉染并表達可促進ALT機制延長端粒的腫瘤細胞獲得皮下成瘤能力,而在轉染前不能。另一項研究也發現[8],確定具有惡性表型的端粒酶陰性的腫瘤細胞,在進行種植轉移模型時,侵襲及轉移能力并不高;但在這些腫瘤細胞重新表達hTERT后即獲得高成瘤能力。本研究通過脂質體法將hTERT基因修飾端粒酶陰性的人骨肉瘤U-2 OS細胞后,檢測其生物學行為及生物力學的改變,以期為研究兩種端粒延長途徑之間關系及機制提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

pIRES2-EGFP(本室保存),克隆有hTERT全長cDNA序列的熒光真核表達載體質粒pIRES2-EGFP-hTERT,由第三軍醫大學西南醫院燒傷研究所梁光萍博士構建[9]。骨肉瘤U-2 OS細胞株(北京協和醫科大學細胞庫)。胃癌KATO Ⅲ細胞株(本室保存)。HAM′S F12液體培養基(Gibico BRL),G418(Amresco,OH,USA),免疫組織化學試劑盒及DAB顯色試劑盒(北京中山公司),兔抗人hTERT pAb(Santa Cruz Biotechnology,CA,USA)。端粒酶活性檢測試劑盒(北京鼎國)。Lipofectamine 2000(Invitrogen,CA,USA)。ECL化學發光試劑盒(Amersham Biosciences)。Transwell小孔(Corning,NY,USA)。可溶性細胞外基質提取物Cultrex BME(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)。

1.2 實驗方法

1.2.1 脂質體介導的pIRES2-EGFP、pIRES2-EGFP-hTERT質粒轉染及hTERT蛋白表達檢測:采用常規分子生物學技術擴增、提取所需質粒。pIRES2-EGFP采用 EcoRⅠ酶切鑒定,pIRES2-EGFP-hTERT采用BamH Ⅰ酶切鑒定。凍存的U-2 OS細胞株按常規方法復蘇后,傳入Costar細胞培養瓶中(25cm2),用HAM′S F12培養液加10%胎牛血清于37℃、5%CO2培養。細胞貼壁生長融合至約 80%時消化傳代。參照Lipofectamine使用說明書的方法轉染細胞,并用300 μ g/mL的G418篩選克隆。克隆篩選成功后,采用免疫組化檢測轉染 pIRES2-EGFP-hTERT后 U-2 OS細胞(U-2 OS/hTERT)hTERT蛋白的表達,以轉染pIRES2-EGFP的U-2 OS細胞(U-2 OS/EGFP)為對照,具體操作步驟參照說明書。采用Western blot檢測轉染pIRES2-EGFP-hTERT后U-2 OS細胞hTERT蛋白表達,以轉染pIRES2-EGFP的U-2 OS細胞為對照。將收集的標本以M-PERtm(Pierce Company)蛋白提取液分別處理細胞,收集細胞總蛋白,BCA法定量后經SDS-PAGE電轉膜,免疫抗體反應,最后化學增強發光法(ECL)顯帶,具體步驟按文獻操作[10],以GAPDH為內參照。

1.2.2 TRAP法檢測端粒酶活性:將培養的U-2 OS,U-2 OS/EGFP,U-2 OS/hTERT細胞用胰酶消化后離心收集,每份樣本細胞數為5×106,各加入1 mL buffer A,混勻,4℃放置15 min。12 000 r/min,4℃離心 5 min,去上清。加入100～200 μ L buffer B,混勻,4 ℃放置30 min其間振動數次。12 000 r/min,4℃離心15 min,棄沉淀 ,留取上清 。取2 μ L 上清,加入 20 μ L PCR液,混勻,20℃保存30 min。90℃保溫3 min。加入 1 μ L CX 引物,1 μ L Taq酶 ,2 滴石蠟油,離心數秒,按下列參數循環35輪:90℃45 s,50℃45 s,72 ℃60 s。取 15 μ L PCR 擴增產物,進行8%聚丙酰胺電泳,銀染觀察結果。以胃癌細胞株KATOⅢ為陽性對照。

1.2.3 熒光實時定量PCR法檢測相對端粒長度:依照Cawthon[11]進行的方法,檢測 3組 U2OS細胞的相對端粒長度。每個樣本端粒PCR的Ct值與36b4 PCR(用作對照的單拷貝基因)的Ct值相比,即為T/S比值。每個樣本的T/S比值,可反映相對端粒長度。兩份DNA樣本同時進行PCR反應。在端粒擴增PCR反應中,正向和反向引物分別用 270和900 nM。(正向引物:5′GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGG TGAGGGT3′, 反向引物 :5′TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTA3′)。擴增36 b4的正向和反向引物分別用300和500 nM。(正 向 引 物:5′CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC3′, 反向引物:5′CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA3′)。 PCR 反 應 儀 采 用Corbett Research Rotor-Gene 3000 Real-time Thermal Cycler(Corbett Research,Cambridge,UK)。兩個PCR反應均起始于95℃孵育10 min以激活Taq DNA多聚酶。隨后,擴增端粒PCR反應條件為95℃15 s,54℃2 min,35個循環。36 b4的PCR擴增反應條件為95℃15 s,58℃1 min,35個循環。為進一步優化條件,將端粒檢測和36 b4樣品在一定范圍內倍比稀釋(200～0.02 ng DNA,10倍比稀釋)后再進行PCR反應,在線性(R2>0.99)范圍內進行端粒相對長度檢測。由于相對T/S比值只有在36b4從每一樣本中等量擴增才能正確反應相對端粒長度,進一步采用Q-PCR確定了36 b4與β-globin基因拷貝數相對比率。β-globin的正向引物:3′-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-5′;反向引物3′-CACCAACTTCATCCACGTTCACC-5′(400 nM each)。擴增反應特異性采用熔解曲線檢測。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞生長周期:將培養的U-2OS,U-2OS/EGFP,U-2 OS/hTERT細胞用胰酶消化后離心收集,調整每份樣本細胞數至1×106個,離心后重懸在含100 mg/L RNA酶和10 g/L碘化丙啶的PBS中,送重慶第三軍醫大學流式細胞室檢測細胞生長周期(Counter Epics Profile II,Coulter Electronics,Inc,Hialeah,FL,USA)。結果用Cell-Quest軟件分析。

1.2.5 微允管法檢測細胞粘附能力:參照文獻[12-13]采用微允管技術(the vacuum micropipette aspiration technique)檢測 U-2 OS,U-2 OS/EGFP,U-2 OS/hTERT等3組細胞對人工基底膜的粘附能力。各組細胞接種于2 cm2的透明培養皿中。接種前,在培養皿底部表面覆蓋一層可溶性人基底膜提取物(Cultrex BME,R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)。吸附力檢測試驗在顯微操作儀下進行。負壓吸引控制器產生5～10 mmHg的分級負壓吸引細胞。細胞剛好被吸離培養皿的負壓吸力即反應其粘附能力,表示為T=×π×(Rp/Rc)2×cosθ。Rp和 Rc分別指微量吸引槍和細胞與培養皿粘附部份的面積。θ指微量吸引槍與培養皿底部的內角。每組隨機測量25個細胞。

1.2.6 細胞侵襲能力的檢測:參考文獻[14]采用Transwell小孔遷移試驗檢測3組細胞的侵襲能力。在侵襲實驗進行前,采用NIH-3T3細胞培養上清作為化學趨化劑(chemoattractant)。用50 μ L濃度為1 mg/mL的基質膠(Matrigel,BD Biosciences,NJ,USA)包被 8μ m 規格的 Transwell小孔板(Costar Transwell filter,Corning,NY,USA),培養基水化后將 U-2 OS,U-2 OS/EGFP,U-2 OS/hTERT等3組細胞分別接種,37℃孵育2 h。每組細胞用無血清培養基適當稀釋后,于每個Transwell小室內接種3×105個細胞后,將 Transwell小孔置于包 300 μ L NIH-3T3上清液及含10%胎牛血清的300 μ L McCoy′s 5a培養基的24孔板內。經24 h孵箱內培養后(37℃,5%CO2),小孔上部分表面用PBS清洗并用脫脂棉試子擦除未遷移細胞。95%乙醇加入Transwell小孔下部分,將細胞脫水5～10 min后,加入2 mL 1%的四溴熒光染料(tetrabromofluorescein dye),染色10～20 min后,隨機取5個視野計數遷移細胞。

2 結 果

2.1 質粒構建和轉染

正義插入pIRES2-EGFP多克隆位點的質粒pIRES2-EGFP-hTERT經Not I限制性內切酶酶切電泳后,可見7.4+1.4 kb 2條電泳帶,與理論值一致(圖1A)。進一步進行測序驗證構建的質粒序列正確(結果未列出)。隨后將 pIRES2-EGFP-hTERT與pIRES2-EGFP(用作空白對照)分別轉染U2OS細胞,G418篩選出穩定轉染的細胞克隆(圖1B)。

圖1 pIRES2-EGFP及pIRES2-EGFP-hTERT酶切鑒定及轉染(A)正義hTERT表達載體質粒(B)G418篩選轉染pIRES2-EGFP-hTERT(a)與pIRES2-EGFP(b)質粒后的克隆

2.2 hTERT蛋白的檢測

為檢測轉染后篩選的細胞表達hTERT的水平,采用免疫組化及Western blot技術檢測轉染了細胞hTERT的表達,結果顯示hTERT/U2OS轉染細胞胞漿及胞核內有棕黃色陽性信號,而EGFP/U2OS及未轉染質粒的U2OS的對照內則未見陽性信號(圖2A)。Western blot結果顯示hTERT/U2OS細胞有 120 kDa的hTERT蛋白表達,而EGFP/U2OS及未轉染質粒的U2OS的對照內則未見陽性信號。36 kDa的GAPDH內參在每組中均有等量表達(圖2B)。

圖2 hTERT在各組細胞中的表達

2.3 TRAP法檢測端粒酶活性及熒光定量PCR檢測相對端粒長度

采用 TRAP法檢測各組細胞端粒酶活性。結果顯示,U-2 OS與U-2 OS/EGFP均未表達端粒酶活性,而在hTERT基因修飾后,U-2 OS細胞表達端粒酶活性與陽性對照的KATO Ⅲ細胞端粒酶活性相近(圖3A)。結果證實將hTERT轉染端粒酶陰性的依賴ALT機制延長端粒的腫瘤細胞后,可激活端粒酶的表達。熒光定量PCR檢測結果表明,hTERT/U2OS,EGFP/U2OS,U2OS的相對端粒長度分別為3.133,1.720和1.643(圖3B)。所有PCR反應的特異性通過熔解曲線檢測(數據未列出)。36b4/β-globin拷貝數的相對比率顯示各樣本中的每個細胞36b4基因等量擴增(數據未列出)。

圖3 hTERT轉染對U2OS細胞端粒酶活性及端粒長度的影響

2.4 流式細胞術檢測各組細胞周期

與EGFP/U2OS及U2OS組相比,hTERT/U2OS組處于G0/G1相的細胞百分比下降,而增殖指數(proliferative index,PI)增高(表1)。這表明hTERT基因轉染促進了U2OS細胞的增殖能力。

表1 hTERT基因修飾U-2 OS細胞后細胞周期檢測結果

2.5 MTT法檢測各組細胞增殖能力

每組細胞設置6個復孔,連續7 d每天測定平均吸收率,繪制增長曲線。結果顯示,與EGFP/U2OS及U2OS組相比,hTERT/U2OS組細胞具有更高的平均吸收率(圖 4)。表明hTERT基因修飾的ALT腫瘤細胞增殖能力增強。

圖4 hTERT基因修飾對U2OS細胞增殖能力的影響

2.6 Transwell小孔法檢測腫瘤細胞體外侵襲強度

經過24小時細胞穿孔后,底層的細胞固定并染色。每組隨機選取5個區域,計數成功穿孔的細胞。結果顯示(圖5),hTERT/U2OS組細胞成功遷移數為154.8±5.2個,顯著高于 EGFP/U2OS組(56.2±7.5,P<0.05)以及未轉染的U2OS組(58.4±4.2,P<0.05)。

2.7 hTERT表達對U2OS細胞在小鼠體內侵襲能力的影響

將hTERT/U2OS,EGFP/U2OS以及未轉染的U2OS細胞從小鼠尾靜脈注射接種,1周后進行活體熒光成像(圖6)。圖中每一個熒光亮點的位置代表一個小鼠肺內腫瘤轉移灶。hTERT/U2OS組的轉移灶平均數顯著高于EGFP/U2OS組(20.3±1.5,7.7±1.5,P<0.001)。而U2OS組則未見熒光轉移組信號。

圖5 hTERT轉染對U2OS細胞侵襲能力的影響

圖6 接種腫瘤細胞后各組小鼠肺內腫瘤轉移灶

2.8 微允管檢測細胞粘附能力

每組隨機選取25個細胞進行測量后取均值。hTERT/U2OS組細胞平均粘附力為(967.6±102.6)×10-10N,而EGFP/U2OS與未轉染的U2OS細胞分別為(694.8±105.6)×10-10N、(707.8±74.2)×10-10N(P<0.05,圖 7B)。結果表明,hTERT基因轉染ALT機制的U2OS腫瘤細胞后,可增強細胞對ECM的粘附能力。這一改變可能在腫瘤侵襲的起始階段起到一定作用。作者進一步進行了侵襲試驗,檢測這一改變對細胞侵襲能力的影響。

3 討 論

圖7 微允管法檢測hTERT基因轉染后對細胞粘附能力的影響

端粒酶延長端粒的作用及機制已為人所知,但在部分永生化細胞系及腫瘤細胞中并無端粒酶激活,推測在這些細胞中可能通過端粒酶非依賴性的旁路途徑(ALT)來維持端粒長度[15]。就目前的統計來看,這類細胞大約占所有腫瘤細胞的10%～15%。其機制目前尚不明確,與端粒酶途徑的關系亦不清楚。Ford et al[16]認為端粒酶途徑抑制重組途徑。也有研究結果表明,永生化的兩個途徑可在細胞內同時起作用[17-18]。Else T等[19]也發現,端粒酶機制在腎上腺皮質癌(A-drenocortical cancer,ACC))中起主要作用,但部分ACC病例則表現出2種機制共存,或單獨依賴ALT機制延端粒。并且,端粒酶機制的ACC惡性程度高于ALT機制的ACC。作為端粒酶最為重要的亞單位,hTERT是端粒酶的限速亞單位,直接決定了端粒酶的活性。當細胞內hTERT被抑制后,短期內端粒的完整性不受影響,但經過數代分裂后,染色體的穩定性即受到干擾。而且,有研究還發現端粒酶可通過誘導細胞表達表皮生長因子(EGFR)[20]或轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)[21]而刺激細胞增殖。在本研究中用hTERT基因修飾端粒酶陰性的U-2 OS細胞,增強U-2 OS細胞端粒酶表達活性后,細胞增殖能力明顯增強。與其它表達hTERT的腫瘤細胞不同的是,U2OS細胞在不表達hTERT的情況下,仍能無限增殖。這說明通過替代途徑延長端粒的腫瘤細胞在hTERT基因修飾后,增殖能力增強。腫瘤細胞永生化的兩個途徑不僅可在U-2 OS細胞內同時起作用,而且可能還有累加效果。但兩種途徑是獨立起作用,還是相互聯系,發揮協同作用,以及替代途徑通過何種機制發揮作用,尚有待進一步研究。

新近研究表明,端粒酶可能促進了腫瘤的侵襲與轉移[22]。之前有研究發現,確定具有惡性表型的端粒酶陰性的腫瘤細胞,在進行種植轉移模型時,侵襲及轉移能力并不高;但在這些腫瘤細胞重新表達hTERT后即獲得高成瘤能力[23]。Bagheri等進一步研究了hTERT表達促進腫瘤細胞侵襲轉移的機制,發現端粒酶的活性調控著黑色素瘤的糖酵解途徑,這可能提高了腫瘤細胞的能量供給狀態,從而促進了腫瘤的侵襲與轉移[24]。雖然目前已有資料支持端粒酶能促進腫瘤細胞的侵襲與轉移,但其機制尚不明確。作者在本研究中利用端粒酶陰性的骨肉瘤細胞系U2OS及轉染EGFP的U2OS作為陰性對照,發現轉染并穩定表達hTERT的細胞對基底膜的粘附能力明顯增強。為進一步探討hTERT/U2OS細胞對基底膜粘附能力增強這一生物力學改變的可能結果,作者進行了Transwell小孔遷移試驗,結果顯示 hTERT/U2OS細胞遷移能力明顯增強。這一結果表明hTERT轉染改變了U2OS細胞與細胞外基質的相互作用能力,從而促進了U2OS細胞的侵襲與轉移能力。基于以上分析,新出現的問題在于端粒酶促進U2OS細胞侵襲與轉移的能力是由于延長了端粒所引起的,還是由于端粒酶本身所引起的。有研究表明,ALT介導的端粒延長的腫瘤細胞,其惡性程度,尤其是侵襲與轉移能力,要低于端粒酶介導的端粒延長的腫瘤細胞[25]。因此推測,很有可能是端粒酶本身的再激活,促進了U2OS細胞的侵襲與轉移能力。Brachner A等[26]也發現端粒酶在陰性腫瘤細胞內的重激活雖不能提高腫瘤細胞染色體穩定,但可促進腫瘤細胞的增殖及侵襲能力。進一步發現,其機制可能是通過端粒酶促進了U2OS細胞與細胞外基質的粘附能力。

本研究從新的角度來探討了端粒酶促進腫瘤惡性表型的機制,以及端粒酶陰性的ALT機制延長端粒的腫瘤細胞與端粒酶的關系。ALT機制在腫瘤細胞中的激活比端粒酶的激活少見得多[27],常發生于端粒酶被抑制的選擇壓力存在時[28-29]。目前,以端粒酶為靶標的腫瘤免疫治療是當前的研究熱點之一,但由于ALT機制的存在,腫瘤對抑制端粒酶治療的耐藥性是必須考慮的問題之一[30]。由于端粒酶表達在同一腫瘤中有所差異,針對端粒酶的腫瘤治療會對腫瘤細胞形成選擇壓力,表達端粒酶的腫瘤細胞立即被殺傷死亡,弱表達端粒酶的腫瘤細胞亞群有可能逐步失去端粒酶表達能力。這一喪失端粒酶表達能力的腫瘤細胞亞群,大部分可能在分裂一定代次后,因端粒耗竭而死亡,但有一小部分有可能激活ALT替代端粒延伸機制,從而造成對針對端粒酶的腫瘤治療出現耐藥性。這一擔憂曾經給炙手可熱的針對端粒酶的腫瘤免疫投下陰影。而本研究結果表明:沒有必要擔心這一可能的耐藥性問題,因為即便在抑制端粒酶活性之后如果出現ALT替代機制的激活,腫瘤細胞也不可能獲得完全的惡性表型,尤其是侵襲和轉移能力不能與端粒酶陽性時相提并論,甚至完全失去侵襲與轉移的能力。

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