HSP70在自然流產患者絨毛組織中的表達及其意義

李 亮

（遼寧省興城市婦女兒童醫院，遼寧興城 125100）

在對子宮內膜容受性的研究中發現，免疫功能異常會導致自然流產。作為在正常子宮內膜的生長和功能維持中起重要作用的熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）家族，無論何種原因引起其表達異常，都將影響子宮內膜，從而可能導致妊娠失敗。本研究通過免疫組化SP法檢測早期自然流產患者絨毛組織中HSP70表達，并與人工流產術取出的正常絨毛進行比較，來探討HSP70在早期自然流產中的作用，從而為本病發生機制提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2008年1月～2009年1月遼寧省興城市婦女兒童醫院婦科門診就診的孕12周以內難免流產患者51例作為實驗組，選取同期孕12周以內無先兆流產而要求終止妊娠者30例作為對照組，排除帶節育器妊娠，無肝腎疾病，近期無感染性病變、未行保胎及雌孕激素替代治療。

1.2 主要試劑

兔抗人HSP70多克隆抗體、SP免疫組化試劑盒、DAB顯色劑為進口分裝，均購于Maxim公司。

1.3 方法

將以負壓吸引取出的絨毛清水沖洗干凈后立即用10%甲醛液固定24 h以上，常規石蠟包埋，4 pm連續切片、編號保存。免疫組化SP染色法，DAB顯色，按ABC免疫組化染色步驟為。①切片常規脫蠟至水，蒸餾水洗5 min×2；②10 ml/L H2O2封閉內源性過氧化物酶30 min，蒸餾水洗5 min×2；③微波修復抗原（pH 6.0檸檬酸緩沖液）10 min，蒸餾水洗5 min×2；④3 mol尿素消化 30 min， PBS(10 mmol/L，pH 7.4)振洗 5 min×2；⑤100 ml/L牛血清白蛋白（BSA）封閉15 min，室溫吸干；⑥滴加一抗 Bad，Bag1（稀釋度為 1∶50，1∶100，1∶200，1∶300，1∶400 和1∶500），4℃過夜，37℃復溫 30 min，PBS 振洗 5 min×2；⑦滴加生物素化橋抗 （1∶100），37℃，40 min，PBS 振洗 5 min×2，En-Vision法滴加 EnVision液 37℃ 40 min，PBS振洗 5 min×2；⑧滴加 ABC 復合物（1∶100），37℃，40 min，PBS 振洗 5 min×2；⑨DAB顯色，襯染，脫水透明，封固，觀察。所示見圖1。

1.4 結果判定標準

采取半定量評分方法進行細胞染色計分，計數100個細胞，根據陽性細胞數目所占百分比計分，陽性細胞數＜24%，記0分；陽性細胞數占25%～75%，記1分；陽性細胞數占76%以上，記2分。按染色深淺計分：淺黃色染色強度為弱，記0分；棕黃色為中等強度染色，記1分；棕褐色為強染色，記2分。以上兩分值相加。每標本取3張切片，每切片取5個視野，計算平均值記為該標本得分：＜2分記為陰性，≥2分記為陽性。

1.5 統計學方法

應用SPSS 13.0統計軟件進行數據處理，采用χ2檢驗進行統計分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

自然流產患者絨毛中HSP70表達顯著增高，陽性率達70.6%，與對照組比較， 差異有統計學意義（χ2=23.63，P＜0.01），見表1。

表1 HSP70在各組絨毛中的表達情況（例）

3 討論

HSP是一組在進化上高度保守的蛋白質，其中又以HSP70分布最廣泛，是重要“分子伴侶”，具有協同免疫、抗凋亡、保護機體免受炎癥因子損害，在應激過程中起重要作用。作為一種應激蛋白，HSP在生理、病理和環境因素改變等情況下均可被誘導產生。研究發現，HSP70在子宮內膜、輸卵管及蛻膜組織中均有表達，且隨月經周期改變而波動，對維持子宮內膜正常生理作用有著重要意義，而在子宮內膜炎、子宮內膜息肉及內膜異位癥等病理情況下呈高表達。最近在應激學的研究中發現，雌孕激素能夠對應激反應產生抑制，妊娠期孕激素水平升高，使得子宮內膜產生容受，妊娠得以維持，這可以解釋部分早期流產是由于孕酮缺乏所致。

本研究發現，早期自然流產患者絨毛組織中HSP70普遍升高，其分子學機制可能為HSP70的異常表達影響了激素和受體的結合，從而導致體內甾體激素信號傳遞中斷，最終導致蛻膜不利于胚胎生長發育。此外，一些學者認為HSP70廣泛存在于所有生物中，人與細菌有部分同源性，人體免疫系統長期暴露于微生物等環境中，反復感染后可能導致自身抗體的產生。子宮作為腹膜外器官，由于性交等因素長期暴露于機會感染的環境中，更增加了接觸過敏原的機會，使得孕前就有可能產生了針對HSP70的自身抗體，導致自然流產。綜上所述，筆者推測HSP可能通過以下幾種機制對生殖功能產生負面影響：HSP在蛻膜組織異常表達引起體內激素紊亂、子宮敏感性增強；HSP蛋白分子具有抗原性，誘導免疫反應而成為免疫系統的攻擊目標；HSP在人與微生物間有相同的抗原序列，結果導致自身免疫等原因而引發流產。

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