阿昔洛韋葡萄糖注射液細菌內毒素檢查方法研究

2010-05-29 06:02:30董林青邱向東黃登峰許廣振

中國醫藥導報 2010年4期

董林青，邱向東，黃登峰，許廣振

（山東勝利股份有限公司生物工程部，山東濟南 250101）

細菌內毒素檢查法又稱鱟試劑法,是一種利用鱟試劑與細菌內毒素發生凝聚反應來檢查藥品中內毒素含量是否符合規定的方法。阿昔洛韋葡萄糖注射液是抗菌藥與抗病毒藥的化學藥品，本文參照文獻[1-3]報道的細菌內毒素檢查法，探討了阿昔洛韋葡萄糖注射液的內毒素檢查的具體方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

鱟試劑（批號：20060427,λ 為 0.125 EU/ml，規格：0.10 ml/支，湛江安度斯生物有限公司；批號：200606040，λ為0.25 EU/ml，規格0.10 ml/支，福州新北生化工業有限公司）；細菌內毒素工作標準品（批號：2006-4，160 EU/支,中國藥品生物制品檢定所）；細菌內毒素檢查用水（批號：20070518，規格：5 ml/支,湛江海洋生物制品廠）；阿昔洛韋葡萄糖注射液3批樣品（批號：070901、070902、070903,國內某醫藥有限公司，規格：100 ml：阿昔洛韋0.1 g，葡萄糖5 g）。

1.2 試藥

XW-80型旋渦混勻器（上海醫科大學儀器廠）；S648型恒溫水浴鍋（上海醫療廠）；吸管；凝集管（75 mm）；試管、吸耳球、封口膜、試管架；超凈工作臺[4]，試驗所用玻璃器皿均經重鉻酸鉀洗液處理后再以250℃烘烤1 h，以去除外源性細菌內毒素[5]。

2 方法與結果

2.1 細菌內毒素限值的建立

按細菌內毒素公式L=K/M（K為人用每千克體重每小時最大可接受的內毒素劑量，K=5 EU/（kg·h），M 為每千克體重每小時最大供試品劑量），根據本品制劑用法與用量中規定,該藥一次劑量為5 mg/kg，成人體重以60 kg計，即成人每日每次最大劑量為 300 mg，則 M=300 ml/60（kg·h），L=5.0/300/60=1.0 EU/ml，但考慮到藥品使用安全性要求及一般大容量輸液細菌內毒素限值要求，將本品的細菌內毒素限值定為0.5 EU/ml為宜。

2.2 鱟試劑標示靈敏度的復核

按《中國藥典》2005年版規定進行靈敏度復核，結果20060427 批靈敏度 λc＝0.171 EU/ml（λb＝0.125 EU/ml）；200606040 批靈敏度 λc＝0.25 EU/ml（λb＝0.25 EU/ml），均符合藥典規定，可用于細菌內毒素的檢查。

2.3 供試品干擾預試驗[6]

根據供試品內毒素限值（L）為0.5 EU/ml,市售鱟試劑λ最低為0.03 EU/ml，計算出鱟試劑λ為0.25、0.06 EU/ml時的供試品稀釋倍數MVD=L/λ,即8.33～16.67倍，則最小有效濃度為0.12~0.06 mg/ml。取3批供試品,用BET水將供試品分別稀釋為 1.00、0.50、0.25 mg/ml，同時選擇 λ=0.25 EU/ml的鱟試劑,將每個濃度供試品液均制備含有2.000 λ（0.5 EU/ml）及0.125 λ（0.06 EU/ml）的細菌內毒素作為供試品陽性液。每一濃度制備2支試管,同時設陰性對照、陽性對照，結果見表1。結果表明，供試品預試驗為稀釋后對以上兩個廠家的鱟試劑均未產生干擾作用。

表1 干擾預試驗

2.4 供試品干擾試驗

根據預試驗結果，用供試品原液及BET水分別將細菌內毒素工作標準品制成表2所示的一系列濃度，每一濃度的細菌內毒素標準溶液平行制備4支;另取細菌內毒素檢查用水和此濃度的稀釋液各制備2支陰性對照管。按下式計算用細菌內毒素檢查用水制成的細菌內毒素標準溶液的反應終點濃度的幾何平均值Es,以及此濃度的稀釋液制成的細菌內毒素標準溶液的反應終點濃度的幾何平均值Et∶Es=lg-1(∑Xs/4)；Et=lg-1(∑Xt/4)。式中 Xs、Xt分別為細菌內毒素檢查用水和稀釋液制成的細菌內毒素標準溶液的反應終點濃度的對數值(lg)。當 Es 在 0.5 λ～2.0 λ(包括 0.5 λ 和 2.0 λ)時，且當 Es/Et在0.5～2.0（包括0.5和2.0）時,則認為供試品在該濃度下不干擾試驗,結果見表2、3。干擾試驗結果表明，阿昔洛韋葡萄糖注射液（1 mg/ml）對鱟試劑不干擾,可以用細菌內毒素檢查法檢查。