“439”橘橙小種子離體無菌再生培養試驗初報

羅君琴 李麗 聶振朋 柯甫志 徐建國 孫建華

（浙江省柑橘研究所 318020）

“439”橘橙是浙江省柑橘研究所以“溫州甌柑”與“改良橙”為親本雜交育成的柑橘品種，該品種具有豐產穩產、耐粗放管理、果實風味及貯藏性好等優點，深受橘農喜歡，是一個有發展希望的優良品種，但美中不足的是，“439”橘橙果實的種子較多，在一定程度上限制了該品種的發展。嘗試培育無籽“439”橘橙對于進一步改良“439”種性及促進其更好發展意義較大。

目前，獲取柑橘三倍體新種質的途徑主要有三條：（1）柑橘四倍體品種與二倍體品種雜交育種，篩選獲取優良三倍體單株。（2）通過離體培養柑橘幼胚乳組織誘導再生芽，獲得三倍體植株。（3）利用柑橘田間自然雜交能產生一定比例的三倍體小種子，通過培育柑橘小種子獲取三倍體新種質[1～4]。專家們普遍認為重量為正常種子1/3以下的小粒種子，容易培養獲取三倍體植株[1，3]。但天然小種子因胚內貯藏養分少，在自然條件下播種繁殖，很難萌發成苗而獲得三倍體植株。本研究旨在利用植株組培手段，研究探索“439”橘橙小種子胚無菌離體培養技術，以克服自然播種繁殖的不足，提高橘橙小種子胚成苗率，為利用天然小種子胚選育“439”橘橙三倍體無籽新種質奠定技術基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 試驗小種子采自浙江省柑橘研究所本部試驗站“439”橘橙結果樹，選正常種子重量1/3以下且大小基本一致的橘橙小種子進行離體無菌再生培養試驗。

1.2 無菌系建立 將試驗小種子裝入錐形瓶加洗滌劑搓洗，再流水沖洗30min，盡可能多地去除種子上附著的粘性物質。洗凈的種子在超凈工作臺上轉入事先已滅菌好的錐形瓶，用70%酒精處理30s～40s→無菌水沖洗→10%次氯酸鈉溶液處理10min～12min→無菌水沖洗，分A、B兩組進行接種。A組去內外種皮，取小胚接種于MS培養中；B組小種子不去種皮（含內外種皮）。直接種于MS培養基。接種25d后，觀察記錄外植體污染情況，50d后觀察統計小種子胚芽無菌萌發個數及成苗率。

1.3 初生芽增殖 待“439”橘橙小種子試管幼苗2～3cm高時，切取初生苗莖段接種于各增殖培養基（表2），于溫度26℃±1℃，光照12h/d，光強2000lx條件下進行增殖培養，增殖培養以MS為基本培養基，pH為5.8，蔗糖含量25g/L。接種45d后分別觀察記錄各處理瓶苗新芽萌發數量及新芽生長狀況。并計算出各培養基處理瓶苗的增殖倍率。

1.4 增殖苗生根 將部分長勢良好、高4cm以上的增殖瓶苗轉接到生根培養基處理（表3），培養25d后觀察統計各處理瓶苗生根率及根生長狀況。

2 結果與分析

2.1 種皮對“439”橘橙小種胚試管無菌萌發的影響 “439”橘橙小種子經過相同的消毒處理后，種胚分去種皮和帶種皮兩種狀態接種于同一批次配制的MS培養基，于26℃±1℃溫度，12h/d光照，2000lx光強條件下培養，接種25d后觀察記錄兩處理外植體污染情況，50d后觀察統計小種子胚芽無菌萌發個數及成苗率，結果如表1所示。

表1 種皮對“439”橘橙小種胚試管無菌萌發的影響

從表1結果可以看出,相同消毒和培養條件下,帶種皮種胚比去種皮種胚容易污染,試驗中去種皮種胚接種培養25d后無外植體污染，帶種皮種胚培養25d存在15%的污染率。同時，不難發現：帶種皮外植體接種后種胚萌發明顯比去種皮處理晚，且成苗率低。去種皮種胚接種7d胚芽便開始萌發，而帶種皮種胚需39d才開始萌發，這可能與種胚外種皮包裹限制了胚吸收外界營養成分或種皮本身含某種生長抑制成分有關。綜上可知，柑橘小種子無菌誘導宜去種皮，以縮短其萌發誘導周期。

2.2 不同激素配比對“439”橘橙莖段再生芽誘導的影響 去種皮小胚無菌培養2周左右，種胚可長至2～3cm高，此時便可切取初代苗莖段進行增殖試驗。增殖試驗共6個處理，每處理20個莖段。接種后45d,觀察記錄各處理瓶苗新芽萌發總數、新芽生長狀況，同時計算增殖倍率，結果如表2所示。

比較表2中處理1、2、3、4可以得知，BA/NAA激素比例相同時，BA O.1～0.5mg/L濃度范圍內,隨著激素濃度的增加,增殖倍率提高。但BA O.5mg/L時，萌發的新芽葉色淡綠，長勢開始走弱，BA 1.0mg/L時，長勢更弱且增殖倍率也開始下降。橘橙莖段再生芽誘導培養基BA使用濃度宜控制在O.1～0.5mg/L范圍內。另外，再比較處理1和5、處理2和6，在BA、NAA相同使用濃度下，適當添加GA，可以在一定程度上增加新芽萌發，因此當柑橘莖段再生芽萌發率較低時，可適當添加GA，促成新芽形成。2.3不同生根培養基對“439”橘橙增殖苗的生根效果 當繼代苗增殖到一定數量時，挑選長勢基本一致、生長良好、高4cm以上的增殖苗進行生根培養試驗，生根培養以1/2MS為基本培養基，4個不同激素處理的生根培養基均添加0.3g/L活性炭。接種時切成單株，每處理30株。接種后25d觀察統計各處理瓶苗生根率及根生長狀況，結果如表3所示。

表3 不同生根培養基對“439”橘橙增殖苗生根影響

從表3中四個生根培養基配方可以看出,“439”橘橙增殖苗在 1/2MS+NAA0.3+IBA0.3培養配方中生根最好,生根率可達83%,其次是1/2MS+NAA0.3配方,生根率80%,繼代苗生根效果尚可。比較四個生根培養基配方中激素種類，不難發現，NAA與IBA有協同增效，共同促進生根的作用。

3 小結

3.1 相同消毒和培養條件下，帶種皮種胚比去種皮種胚外植體接種易污染、萌發晚且成苗率低，可能與種胚外種皮包裹限制了胚吸收外界營養成分或種皮本身含某種生長抑制成分有關，柑橘小種子無菌誘導宜去種皮，以縮短其萌發誘導周期。

3.2 橘橙莖段再生芽誘導培養基BA使用濃度宜控制在0.1～0.5mg/L范圍內,在此濃度范圍內,BA/NAA激素比例保持不變時,隨著BA濃度的增加,初生芽增殖倍率提高。與此同時，發現BA、NAA控制在合理濃度范圍時，適當添加GA，可以在一定程度上促成新芽的萌發。

3.3 在本試驗的四個生根培養配方中，“439”橘橙增殖在1/2MS+NAA0.3+IBAO.3培養配方中生根最好,其次是1/2MS+NAAO.3配方。與此同時，發現NAA與IBA有協同增效，共同促進生根的作用。

[1]高峰，張進仁，吳安仁,等.離體培養柑橘小胚獲得三倍體植株[J].遺傳,1998,10(6)：9～11

[2]祝進，王永清，倪彬.尤力克檸檬小種子離體培養研究[J].安徽農業科學,2007,35(9)：2573～2574

[3]周今華.從本地早小粒種子獲得三倍體植株的研究[J].浙江柑橘,1984,(3)：47

[4]陳力耕,胡運權.從二倍體柑橘獲得三倍體的研究[J].園藝學報,1981,8(2)：11～13