炮制對荷葉中荷葉堿和槲皮素含量的影響

董春永， 張學蘭， 李慧芬

（山東中醫藥大學，山東濟南 250355）

荷葉為睡蓮科植物蓮Nelumbo nuciferaGaertn.的干燥葉，具有清熱解暑，升發清陽，涼血止血的功效［1］。現代對荷葉的炮制方法主要有煅炭［1］和炒炭［2］兩種。研究表明，荷葉中主要含有生物堿、黃酮類、有機酸等成分。生物堿類成分有荷葉堿、原荷葉堿、N－去甲荷葉堿、蓮堿等;黃酮類成分有金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、蓮苷等;有機酸類成分有酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸等［3，4］。炮制對荷葉中荷葉堿和槲皮素含量有何影響，尚未見報道。本研究以荷葉堿和槲皮素含量為指標，對荷葉生品、煅炭品及炒炭品進行比較，為探討荷葉的炮制機理、篩選優化荷葉飲片的炮制工藝，提供實驗依據。

1 儀器和試藥

Agilent1100高效液相色譜儀（美國Agilent公司）;FA1604N型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）;PM PLUS型紅外測溫儀（美國 Raytek公司）;多星電炒鍋（淄博多星電器集團有限責任公司）。

荷葉購自濟南市建聯中藥店，經本校周鳳琴教授鑒定為睡蓮科植物蓮Nelumbo nuciferaGaertn.的干燥葉經加工而成的絲狀片，產地山東。煅荷葉炭:按《中國藥典》2005年版一部荷葉項下方法依法炮制［1］。取凈荷葉絲50 g，置電炒鍋內，密封，230 ℃煅制3 h，放涼，取出。成品表面烏黑色。炒荷葉炭:按《山東省中藥炮制規范》2002年版荷葉項下方法依法炮制［2］。取凈荷葉絲50 g，置電炒鍋內，280℃（用紅外測溫儀測定鍋底溫度）炒制5 min，取出，放涼。成品表面烏黑色。荷葉堿、槲皮素對照品（中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號為111566－200402、100081－200406）;高效液相用乙腈、甲醇（色譜純）;其余試劑均為A.R。

2 方法與結果

2.1 水分含量測定 取各樣品粗粉約2 g，精密稱定，按《中國藥典》2005年版一部附錄Ⅸ H水分測定法（烘干法）測定（n=3），結果生荷葉、煅荷葉炭及炒荷葉炭的水分含量依次為10.44%、4.31%、4.21%。按干燥品計算樣品中各指標成分的含量。

2.2 荷葉堿含量測定［1］

2.2.1 供試品溶液的制備 取各樣品粗粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流2.5 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續濾液5 mL，置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液即得。

2.2.2 對照品溶液制備 取荷葉堿對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋制成濃度為1.355 mg/mL的溶液，搖勻，即得。

2.2.3 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18，200 mm×4.6 mm;流動相∶乙腈－水－三乙胺－冰醋酸（27∶70.6∶1.6∶0.78）;流速:1 mL/min;柱溫:30 ℃;檢測波長:270 nm。

2.2.4 線性關系考察 精密吸取荷葉堿對照品溶液0.1、0.5、1、2、3 mL，分別置 10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。各取20 μL注入液相色譜儀，測定峰面積。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，作線性回歸，結果荷葉堿在 2.71 μg/mL ～81.30 μg/mL范圍內線性關系良好，回歸方程為Y=67.02X+21.26，r=0.999 9。

2.2.5 精密度試驗 取生荷葉供試品溶液，連續進樣6次，結果6次測得荷葉堿峰面積的 RSD為1.22%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗 取生荷葉供試品溶液，在室溫下自然放置，分別在 0、2、4、6、8、12 h 進行測定，結果6次測得荷葉堿峰面積的RSD為1.32%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.2.7 重復性試驗 取生荷葉樣品，平行6份，按供試品溶液制備方法制備并測定，結果6次測得荷葉堿含量的RSD為1.38%。表明測定方法重復性良好。

2.2.8 樣品含量測定 取各樣品粗粉，按2.2.1項下方法分別制得供試品溶液，分別精密吸取20 μL，注入液相色譜儀，記錄荷葉堿峰面積，分別代入回歸方程計算荷葉堿含量，色譜圖見圖1，結果見表1。

圖1 荷葉堿對照品（A）、荷葉生品（B）、荷葉煅炭品（C）、荷葉炒炭品（D）HPLC圖

表1 荷葉不同炮制品中荷葉堿和槲皮素含量比較（n=3）

2.2.9 加樣回收率試驗 取已測知荷葉堿含量的生荷葉粗粉共6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別精密加入荷葉堿對照品溶液（0.271 mg/mL）5 mL，按2.2.1項下方法制得供試品溶液，分別精密吸取20 μL，注入液相色譜儀，記錄荷葉堿峰面積，計算含量和回收率，結果其平均回收率為99.57%，RSD為1.13%。

2.3 槲皮素含量測定［5］

2.3.1 供試品溶液制備 取各樣品粗粉約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用60%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液即得。

2.3.2 對照品溶液制備 取槲皮素對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋制成濃度為1.000 mg/mL的溶液，搖勻，即得。

2.3.3 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18;200 mm×4.6 mm;流動相∶甲醇－0.2%磷酸溶液（55∶45）;流速:1 mL/min;柱溫:30℃;檢測波長:360 nm。

2.3.4 線性關系考察 精密吸取荷葉堿對照品溶液0.1、0.5、1、2、3 mL，分別置5 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。各取20 μL注入液相色譜儀，測定峰面積。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，作線性回歸，結果槲皮素在0.02 mg/mL～0.6 mg/mL范圍內線性關系良好，回歸方程為Y=10 116X+23.717，r=0.999 9。

2.3.5 精密度試驗 取炒荷葉炭供試品溶液，連續進樣6次，記錄峰面積，結果6次測得荷葉堿平均峰面積的RSD為1.34%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩定性試驗 取炒荷葉炭供試品溶液，在室溫下避光自然放置，分別在 0、2、4、6、8、12 h 進行測定，結果荷葉堿平均峰面積的RSD為1.12%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.3.7 重復性試驗 取炒荷葉炭樣品，平行6份，按供試品溶液制備方法制備并測定，結果荷葉堿平均含量的RSD為1.31%。表明測定方法重復性良好。

2.3.8 樣品含量測定 取各樣品粗粉，按2.3.1項下方法分別制得供試品溶液，分別精密吸取20μL，注入液相色譜儀，記錄槲皮素峰面積，分別代入回歸方程計算槲皮素含量，色譜圖見圖2，結果見表1。

圖2 槲皮素對照品（A）、荷葉生品（B）、荷葉煅炭品（C）、荷葉炒炭品（D）HPLC圖

2.3.9 加樣回收率試驗 取已測知含量的炒荷葉炭粗粉，共6份，每份約0.5 g，精密稱定，分別精密加入槲皮素對照品溶液（6.75 mg/mL）1 mL，按2.3.1項下方法制得供試品溶液，分別精密吸取20 μL，注入液相色譜儀，記錄槲皮素峰面積，計算含量和回收率，結果其平均回收率為98.69%，RSD為1.23%。

3 小結和討論

3.1 測定了荷葉生品、煅炭品和炒炭品中荷葉堿和槲皮素含量，結果表明，荷葉經煅炭或炒炭后，荷葉堿損失殆盡，而槲皮素含量較生品增加6倍多。說明加熱炮制對荷葉中荷葉堿和槲皮素含量有顯著影響。本研究結果為荷葉飲片的炮制和質量控制提供了實驗依據。

3.2 荷葉堿的熔點較低為165℃，荷葉制炭后荷葉堿含量大幅度降低分析是由于經高溫加熱使荷葉堿受熱破壞所致。荷葉中槲皮素多以結合苷的形式存在［6］，荷葉中的金絲桃苷、異槲皮苷的熔點依次為197～199℃和198～200℃，二者的苷元均為槲皮素，荷葉制炭后槲皮素含量顯著升高，分析可能與金絲桃苷和異槲皮苷受熱后分解生成槲皮素有關，對此有待進一步深入研究。

3.3 傳統認為，生荷葉長于清熱解暑、升發清陽，制炭后可增強其止血作用［7］。藥理研究表明，荷葉堿可明顯降低小鼠血清中甘油三酯和膽固醇的含量［8］，槲皮素對二磷酸腺苷、膠原、鈣離子載體和花生四烯酸等誘導劑引起的人血小板聚集反應有顯著的抑制作用［9］。荷葉制炭后止血作用增強分析與槲皮素含量增加有關，而荷葉制炭后荷葉堿含量降低與其止血作用增強有何關系有待進一步研究探討。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:195.

［2］山東省藥品監督管理局·山東省中藥炮制規范［M］.濟南:山東友誼出版社，2002:336.

［3］劉淑萍，樊淑彥，侯海妮，等.荷葉化學成分及藥理作用研究進展［J］.河北醫科大學學報，2003，25（4）:254－256.

［4］田 娜，劉仲華，黃建安，等.高效制備液相色譜法從荷葉中分離制備黃酮類化合物［J］.色譜，2007，25（1）:88－92.

［5］雍國新.荷葉中槲皮素提取工藝研究［J］.安徽農業科學，2008，36（14）:5705－5706.

［6］鄔曉鷗，熊 英.荷葉質量標準研究［J］.現代中藥研究與實踐，2004，18（4）:27－29.

［7］原思通.醫用中藥飲片學［M］.北京:人民衛生出版社，2001:198.

［8］林木仙，林國榮，陳劍鋒，等.高純度荷葉堿的制備及其藥效研究［J］.福州大學學報，2008，36（2）:303－308.

［9］顧振綸，錢曾年，肖 東，等.槲皮素對血小板的抑制作用及其機理分析［J］.蘇州醫學院學報，1991，11（4）:262－265.