MEKC-DAD測定山茱萸飲片中獐牙菜苷和馬錢苷含量

李俊松， 劉訓紅， 張月嬋， 蔡寶昌， 尹 娣

（南京中醫藥大學，江蘇省中藥炮制重點實驗室，江蘇南京 210029）

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalisSiebl.et Zucc.的干燥成熟果肉。臨床上多用酒山萸肉。山萸肉長于斂汗固脫，用于自汗或大汗不止，陰虛盜汗;經酒蒸制后，補益肝腎作用增強，常用于眩暈耳鳴，陽痿遺精，遺尿，尿頻，月經過多或崩漏，腰部酸痛等［1］。另外還有清蒸品，滋補作用弱于酒蒸品［2］。現代研究表明，環烯醚萜苷、有機酸、多糖、鞣質等是山茱萸的有效成分。環烯醚萜苷成分如獐牙菜苷有抗肝細胞損傷作用［3］，馬錢苷對免疫反應有雙向調節作用、對半乳糖胺所致肝損傷的保護作用、對艾氏腹水瘤細胞、淋巴細胞、人骨髓瘤細胞SP20均有一定的保護作用［4］。

山茱萸的質量控制，《中國藥典》2005版規定以馬錢苷為控制指標，采用高效液相色譜法測定，文獻也多采用高效液相色譜法測定山茱萸中環烯醚萜含量［5－7］，紫外法分光光度法測定山茱萸環烯醚萜苷總苷含量也有報道［8］。

本實驗采用高效毛細管電泳法進行了山茱萸飲片中環烯醚萜苷的測定方法研究。實驗中選擇硼砂溶液為緩沖液，對獐牙菜苷和馬錢苷的毛細管電泳遷移行為進行了研究，并考察了緩沖溶液濃度、表面活性劑濃度、有機溶劑、緩沖溶液pH、運行電壓、運行溫度等因素對待測物質分離的影響，建立了一種簡單、快速、能同時分離測定山茱萸飲片中獐牙菜苷和馬錢苷含量的毛細管電泳分析新方法。

1 儀器與試劑

Agilent型高效毛細管電泳儀（型號:G1600 AX），包括惠普化學工作站，DAD檢測器，自動進樣器;BUCHI旋轉蒸發儀（型號:Rotavapor R－3）;AG 285電子天平;PHS－3C型PH計（上海康儀儀器有限公司）;KQ－500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

獐牙菜苷對照品（江蘇省藥物研究所制備）;馬錢苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號:111640－200503）。其他化學試劑均為分析純，實驗用水為超純水。山茱萸酒制品為不同產地藥材加工或商品飲片，編號:S1－河南 （080625），S2－陜西（080626），S3－浙 江 臨 安 （080627），S4－安 徽（081201），S5－山西（081201），S1－S3 由浙江中醫藥大學中藥飲片廠按2005年版《中國藥典》加工制得，S4－S5由亳州市中藥飲片廠按2005年版《中國藥典》加工制得，S6－S7 由南京國醫堂提供，S8－S9 由南京百草堂提供，S10－傳統中醫門診部提供;山茱萸生品編號:S11－河南（Y080625），S12－陜西（Y080626）。均經作者鑒定為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalisSiebl.et Zucc.的干燥成熟果肉。

2 方法與結果

2.1 電泳條件 未涂漬標準熔融石英毛細管（75 μm i.d.×64.5 cm，有效長度56 cm）（Agilent科技有限公司）;檢測波長:240 nm;壓力進樣:5 kPa×8 s;分離電壓:10 kV;毛細管溫度:18℃;運行緩沖液50 mmol/L 硼砂－40 mmol/L SDS－5%乙腈 （pH 9.5）。毛細管使用前以0.1 mmol/L氫氧化鈉溶液、超純水和運行緩沖液依次通過壓力沖洗5、10、5 min。

2.2 對照品溶液的制備 以80%甲醇溶液為溶劑，配置獐牙菜苷、馬錢苷混合對照品貯備液（獐牙菜苷192.5 mg/L、馬錢苷1 210 mg/L），在冰箱中保存。在使用前，精密量取上述混合對照品貯備液1、2、4、6、10 mL 于10 mL 量瓶中，80%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜過濾，作為不同濃度的工作溶液。

2.3 供試品溶液的配制 取山茱萸粉末1 g（過50目篩），至100 mL量瓶中，精密稱定，加80%甲醇50 mL，精密稱定，浸漬1 h后，超聲提取60 min，放冷，再精密稱定，以80%甲醇補足其重量，搖勻，濾過。取濾液30 mL，水浴蒸干，80%甲醇溶解并定容至5 mL，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.4 線性關系考察 取上述獐牙菜苷、馬錢苷不同濃度的工作溶液，在選定的電泳優化條件下，測定，以對照品的峰面積（Y）對相應的濃度（X）進行線性回歸，得回歸方程，相關系數及線性范圍;以信噪比S/N=3對應濃度確定最低檢測限（LOD），以信噪比S/N=10對應濃度確定最低定量限（LOQ）。見表1。

表1 獐牙菜苷與馬錢苷的標準曲線、檢測限與定量限（n=2）

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度和穩定性試驗 在選定的電泳優化條件下，將混合標準品溶液連續進樣6次，獐牙菜苷的遷移時間RSD為0.63%，峰面積RSD為1.38%;馬錢苷的遷移時間RSD為0.72%，峰面積RSD為1.98%。取上述混合對照品溶液，分別于0、1、2、4、8、16、24 h進樣，獐牙菜苷的遷移時間 RSD為1.21%，峰面積RSD為2.31%;馬錢苷的遷移時間RSD為0.92%，峰面積RSD為2.30%。

2.5.2 重復性試驗 取河南酒制品（S1）5份，精密稱定，按照2.3項下方法，分別制備供試液，在選定的電泳條件下，測定，獐牙菜苷的遷移時間RSD為1.63%，峰面積RSD為2.51%;馬錢苷的遷移時間RSD為1.72%，峰面積RSD為2.38%。

2.5.3 回收率試驗 精密稱定河南酒制品（S1）5份，加入混合標準品各2 mL，按照2.3項下方法，制備供試液，在選定的電泳條件下，測定，以外標兩點法計算含量，獐牙菜苷與馬錢苷回收率分別為100.38%，100.41%;RSD分別為2.80%、2.98%，表明該方法可靠。

2.6 樣品測定 在選定的電泳優化條件下，將供試品溶液注入高效毛細管電泳儀中，進行測定，以外標兩點法計算含量，對照品和山茱萸樣品HPCE－DAD色譜圖見圖1，根據相應的線性關系計算樣品中獐牙菜苷與馬錢苷含量，結果見表2。

表2 HPCE法測定山茱萸分析結果（n=4）

圖1 對照品溶液和山茱萸樣品HPEC-DAD色譜圖

3 結論與討論

3.1 電泳條件的優化 毛細管電泳（HPCE）的分離選擇性及分離效率主要取決于緩沖液的類型、酸度、濃度，緩沖液添加劑、電壓、溫度等也有一定影響。實驗對山茱萸飲片中的獐牙菜苷、馬錢苷進行了分離研究，重點考察了緩沖溶液濃度、表面活性劑濃度、有機溶劑、緩沖溶液pH、運行電壓、運行溫度等實驗條件對分離的影響。

3.1.1 緩沖液體系的選擇 本實驗考察了硼砂，乙酸銨，硼砂－SDS及硼砂－SDS－乙腈體系的緩沖溶液，發現選用硼砂緩沖液或乙酸銨緩沖液時，獐牙菜苷及馬錢苷分離度很差，基本不能分開，但當在硼砂緩沖液中加入SDS，分離有所改善，但是獐牙菜苷及馬錢苷分離度還是不能達到Rs≥1.5的要求，故需要加入有機溶劑以增加樣品溶液中非水物質的溶解度，同時也會影響膠束相和流動相的性質，進而改變溶質在水相和膠束相的分配比例，有利于提高分離效率，當加入乙腈后分離度變好，Rs＞1.5。故選擇硼砂－SDS－乙腈緩沖體系。

3.1.2 硼砂濃度的影響 緩沖液濃度是影響被測物遷移時間和分離度的一個重要因素，這是因為緩沖液的濃度決定了溶液的黏度系數、溶質的擴散系數以及毛細管內壁的ξ電位。本實驗考察了8～50 mmol/L的硼砂緩沖溶液，結果發現遷移時間和分離度隨著緩沖液濃度的升高而增大。當緩沖液濃度到50 mmol/L時對照品的峰形和分離度最佳。

3.1.3 SDS 濃度的影響 考察了10、15、20、25、30、35、40 mmol/L 7個SDS濃度下的分離情況，當SDS濃度為40 mmol/L時，山茱萸中成分的分離情況較理想，且被測組分的峰形及遷移時間較好。

3.1.4 乙腈濃度的影響 在膠束電泳（MECC）中，乙腈作為有機添加劑，有利于提高憎水溶質在水相中的溶解性，并且會影響膠束相和流動相的性質，進而改變了溶質在水相和膠束相的分配比例，有利于提高分離效率。實驗考察了5%、10%、15%、20%（V/V）乙腈濃度對山茱萸中成分分離的影響，發現乙腈濃度為5%時，峰形較好，且各組分的分離也達到 Rs＞1.5。

3.1.5 緩沖溶液pH的選擇 緩沖液的pH直接影響毛細管表面的ξ電勢，從而影響電滲流的方向和速度，同時溶液的pH也決定樣品中各組分分子的表面電荷數，從而影響組分的遷移時間和分離度，故本實驗對緩沖液的pH進行了優化選擇以獲得較好的分離條件。考察了pH 8.8～9.5的緩沖液，發現隨著pH值的增大，各組分的分離度增加而遷移時間延長，峰高亦增高，當pH為9.5時被測組分可達到基線基本分離。

3.1.6 運行電壓的選擇 實驗在分離電壓10～22 kV的條件下考察了對各組分遷移時間的影響，實驗結果表明，分離電壓越高，組分的遷移時間越短，不利于分離，當分離電壓為10 kV時樣品及對照品各待測組分可以達到基線基本分離。

3.1.7 運行溫度的選擇 毛細管電泳中，運行溫度也影響電場的強度，從而影響電滲流速度和帶電物質的遷移速率，影響分析物的遷移時間。本實驗考察了運行溫度15～30℃的條件下對各組分遷移時間的影響，實驗結果表明運行溫度越高，組分的遷移時間越短，但當運行溫度為18℃時樣品的各組分分離效果好，且分析時間縮短。

3.1.8 檢測波長的選擇 取山茱萸樣品，按選定制備供試品溶液，電泳條件進樣，在190～600 nm處三維圖譜，結果表明240 nm各峰分離最好，因此，選擇240 nm作為檢測波長。

3.2 實驗結果表明，不同產地或商品山茱萸酒制品中獐牙菜苷與馬錢苷的含量具有一定差異，其中馬錢苷以河南、陜西及安徽產的飲片較高，所有樣品中獐牙菜苷含量均很低或未檢出。山茱萸生品與相對應的酒制品中獐牙菜苷與馬錢苷的含量也有差異，獐牙菜苷酒制后有所增加，馬錢苷以酒制品升高或變化不明顯，其炮制過程中含量變化規律仍需進一步探討。

3.3 本實驗建立膠束電動毛細管色譜二極管陣列檢測法（MEKC－DAD）同時測定山茱萸飲片中獐牙菜苷及馬錢苷含量，該方法簡便、靈敏，重復性好，可用于山茱萸飲片內在質量分析的評價與控制。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:20.

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