馬來酸咪達唑侖片在漢族健康人體內的藥動學研究Δ

郭濤，毛桂福，夏東亞，顏鳴，唐云彪（.沈陽軍區總醫院藥劑科，沈陽市 006；.沈陽藥科大學藥學院，沈陽市 006）

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜系統，包括600型四元泵、2487紫外檢測器（美國Waters公司）；AUW120D電子分析天平（日本島津公司）；PB-10 Sartorius普及型pH計（德國賽多利斯公司）；YKH-Ⅱ型液體快速混合器（江西醫療儀器廠）；KQ3200DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TDL-5臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；L2199氮吹儀（北京來亨科學儀器公司）。

1.2 試藥

馬來酸咪達唑侖片（江蘇恩華藥業股份有限公司，規格：每片15 mg，批號：06052401）；馬來酸咪達唑侖標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號：171250-200401，含量：100.0%）；內標：三唑侖標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號：171250-200602，含量：100.0%）；甲醇、乙腈為色譜純，其余均為國產分析純，水為雙重蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 受試者選擇

選擇漢族健康受試者10名，男、女各半，年齡（23±2）歲，體質量（62.4±6.4）kg，身高（167±9）cm，體質量指數（BMI）（22.5±2.3）kg·m－2。其父母、祖父母、外祖父母均為漢族婚配；試驗前進行病史詢問和體格檢查，血常規、肝功、腎功等均正常；無藥物過敏史及藥物依賴史，無精神病史，不嗜煙、酒；試驗前15天未服用任何藥物；試驗期間禁煙、酒及含咖啡因的飲料。受試者在試驗前了解試驗目的、方法、意義以及可能發生的不良反應，并簽署知情同意書。

2.2 給藥方法

受試者試驗前1天進食清淡晚餐后禁食12 h，試驗日晨空腹口服咪達唑侖片15 mg，用溫開水200 mL送服。服藥2 h后方可飲水，服藥4、10 h后進食統一標準餐。試驗期間避免劇烈活動。試驗方案經沈陽軍區總醫院醫學倫理委員會批準。

2.3 血樣采集

于服藥前0 h和服藥后0.33、0.67、1、1.5、2、2.5、3、4、6、9、12 h時分別由受試者前臂靜脈取血液5 mL，置肝素抗凝管中并搖勻，離心分離血漿，于－25℃冷凍保存。

2.4 血漿樣品處理

取血漿1.0 mL，加入內標溶液（40 ng·mL－1三唑侖溶液）50 μL和磷酸氫二鉀緩沖溶液0.2 mL，混勻后加入環己烷-三氯甲烷（4∶1）混合液4.0 mL，渦旋振蕩2 min，4000 r·min－1離心10 min，取上層有機相置5 mL離心管中，于55℃條件下用空氣吹干，殘渣加甲醇-10 mmol·L－1鹽酸（45∶55）混合溶劑80 μL 和正己烷50 μL，渦旋振蕩1 min，2500 r·min－1離心1 min，棄去上層有機相，取下層溶液20 μL進樣。

2.5 色譜條件

色譜柱：Diamosil C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-乙腈-10 mmol·L－1醋酸銨溶液（pH 3.95）（50.2∶8∶41.8）；流速：1.1 mL·min－1；檢測波長：220 nm；柱溫：室溫；靈敏度為0.5AUFS。在該色譜條件下，混合空白血漿、混合空白血漿加馬來酸咪達唑侖對照品與內標、血漿樣品加內標分析結果表明，咪達唑侖與內標峰形良好，血漿內源性雜質、代謝物等不干擾樣品測定。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+馬來酸咪達唑侖對照品+內標；C.受試者的血漿樣品+內標；1.三唑侖；2.咪達唑侖Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma spiked with midazolam and IS；C.plasma sample spiked with IS；1.triazolam；2.midazolam

2.6 標準曲線的制備

精密量取系列濃度的對照品溶液各50 μL至8支具塞玻璃試管中，再加入空白血漿1 mL，使咪達唑侖血漿濃度分別為2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0、320.0 ng·mL－1，按“2.4”項下方法操作，進樣測定，記錄色譜。以血漿樣品中待測物濃度（X）為橫坐標，待測物與內標的峰面積比值（Y）為縱坐標，用加權（W＝1/C2）最小二乘法進行回歸運算，求得直線回歸方程：Y＝0.037X－0.010（r＝0.9980）。結果表明，咪達唑侖血藥濃度在2.5～320.0 ng·mL－1范圍內線性關系良好。咪達唑侖血漿的最低定量濃度為2.5 ng·mL－1。

2.7 方法回收率

取空白血漿1 mL，加入適量對照品溶液，制備低、中、高（5.0、40.0、160.0 ng·mL－1）3種濃度的質控樣品，按“2.4”項下方法操作，每一濃度測定5個樣本，計算方法回收率，結果見表1。

表1 方法回收率試驗結果（n＝5）Tab 1 Recovery test results（n＝5）

2.8 提取回收率和精密度

取空白血漿1 mL，加入適量對照品溶液制備低、中、高（5.0、40.0、160.0 ng·mL－1）3 種濃度的質控樣品，按“2.4”項下方法操作，每一濃度測定5個樣本，計算方法的日內精密度，低、中、高3種濃度的日內RSD分別為15.5%、8.0%和4.9%。連續測定5 d，計算方法的日間精密度，低、中、高3種濃度的日間RSD分別為18.3%、10.2%和3.2%。另將測得的質控血漿樣品的峰面積與相同濃度對照品溶液直接進樣測得的色譜峰面積之比，計算提取回收率，結果低、中、高3種濃度的提取回收率分別為80.5%、80.0%、84.4%。

2.9 樣品穩定性考察

取空白血漿1 mL，制備低、中、高（5.0、40.0、160.0 ng·mL－1）3種濃度的血漿樣品，分別在室溫、－25℃冰凍和凍融條件下存放。結果表明，咪達唑侖的血漿樣品在室溫放置8 h、－25℃冰凍14 d和反復凍融3次的條件下都是穩定的。

2.10 藥-時曲線

10名受試者口服咪達唑侖片15 mg后，測得的平均藥-時曲線見圖2。

圖2 受試者單劑量口服咪達唑侖片15 mg后的平均藥-時曲線Fig 2 Mean plasma concentration-time curve of midazolam after administration of a single oral dose of 15 mg midazolam tablets in 10 healthy volunteers

2.11 藥動學參數

采用孫瑞元等編寫的DAS 2.0藥動學軟件對藥-時數據進行擬合，以非室模型估算藥動學參數，采用梯形法計算AUC0～12，Cmax與tmax為實測值的平均數，結果詳見表2。

表2 受試者單劑量口服咪達唑侖片15 mg后的藥動學參數Tab 2 The pharmacokinetic parameters of midazolam after administration of a single oral dose of 15 mg midazolam tablets in 10 healthy volunteers

2.12 安全性評價

在整個試驗過程中，10名健康漢族受試者均未發生明顯不良反應，表明受試者對單劑量口服咪達唑侖片有較好的耐受性。

3 討論

本文建立的HPLC法，以甲醇、乙腈和10 mmol·L－1醋酸銨溶液組成三元流動相，能消除代謝物與內源性雜質對咪達唑侖和內標的干擾，使最低定量濃度達到2.5 ng·mL－1，且各項指標符合臨床藥動學研究的要求。

服藥30～60 min后，有9名受試者陸續入睡，2～4 h后陸續醒來，多數受試者不能回憶睡眠期間血樣采集的事情，這與咪達唑侖的作用特點相符。但1名女性受試者在整個試驗過程中未入睡，測定其血藥濃度后，發現有吸收滯后現象，且其濃度普遍較低。

漢族健康受試者單次口服15 mg咪達唑侖片劑后，tmax、t1/2分別與國內文獻[1，3]報道相似。Cmax、AUC0～12分別與文獻[1]報道的（220.57±67.64）ng·mL－1和（587.86±161.65）ng·h·mL－1有較大差異，與文獻[3]報道的67.2～154.0 ng·mL－1及128～382 ng·h·mL－1相近。從表2看，各項藥動學參數都存在較大的個體差異，由于咪達唑侖的吸收和代謝過程都受到腸道、肝臟細胞色素P450（CYP）3A酶的催化代謝作用[5]，而遺傳、環境、生理等多種因素導致CYP3A酶活性可相差50倍[6]，因而導致了咪達唑侖藥動學過程的個體差異，臨床應用時應該注意個體化給藥。

7位受試者的藥-時曲線圖有雙峰現象，第1個峰出現在給藥后0.33～1 h，第2個峰出現在給藥后2～3 h。產生雙峰現象的機制主要與其松弛胃腸平滑肌，影響胃的排空有關[7，8]。國內未見有關咪達唑侖片劑雙峰吸收現象的報道。

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[3]Bolon M，Boulieu R，Flamens C，et al.Sedation induced by midazolam in intensive care：pharmacologic and pharmacokinetic aspects[J].Ann Fr Anesth Reanim，2002，21（6）：478.

[4]Krupka E，Venisse N，Lafay C，et al.Probe of CYP3A by a single-point blood measurement after oral administration of midazolam in healthy elderly volunteers[J].Eur J Clin Pharmacol，2006，62（8）：653.

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