輻射損傷所致血虛證小鼠模型及四物湯反證的代謝組學(xué)研究*

霍 超 ，王 穆 ，馬增春 ，張 琪 ，顏賢忠 ，張伯禮 ，高 月

（1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所藥理與毒理研究室，北京 100850；

2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)分析中心，北京 100850；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

輻射損傷所致血虛證小鼠模型及四物湯反證的代謝組學(xué)研究*

霍 超1，王 穆1，馬增春1，張 琪2，顏賢忠2，張伯禮3，高 月1

（1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所藥理與毒理研究室，北京 100850；

2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)分析中心，北京 100850；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

[目的]通過檢測(cè)輻射損傷所致血虛證及用四物湯干預(yù)治療后小鼠內(nèi)源性代謝物的變化，確定輻射損傷所致血虛證小鼠的血清及組織相關(guān)的生物標(biāo)記物，基于代謝組學(xué)的方法考察血虛證證本質(zhì)及四物湯的作用機(jī)制。[方法]C57小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組、輻射造模組、四物湯反證組。造模7 d后于小鼠股動(dòng)脈取血，同時(shí)取脾臟、胸腺及股骨骨髓，并分別提取血清及組織的脂溶性和水溶性代謝物。[結(jié)果]主成分分析結(jié)果顯示正常組、血虛證模型組以及四物湯反證組能夠明顯的區(qū)分。[結(jié)論]四物湯治療血虛證的機(jī)制可能與穩(wěn)定細(xì)胞膜，維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡；調(diào)節(jié)糖酵解，促進(jìn)機(jī)體正常能量代謝以及增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力、免疫力有關(guān)。

輻射；四物湯；血虛證；代謝組學(xué)；核磁共振

血虛證是臨床常見證候，表現(xiàn)為血液虧虛、臟腑百脈失調(diào)、全身虛弱等。有關(guān)血虛證的動(dòng)物模型造模方法的研究已經(jīng)開展了大量的工作，其中γ射線造模是發(fā)展比較成熟的方法之一，輻射主要造成白細(xì)胞下降，骨髓造血功能障礙[1]。四物湯是治療中醫(yī)血虛證的首選藥，課題組已經(jīng)在外周血象、骨髓造血干/祖細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量、CD34+細(xì)胞表達(dá)，細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和造血及免疫相關(guān)基因、蛋白的表達(dá)等方面考證了其藥理作用[2-5]。實(shí)驗(yàn)利用基于核磁共振波譜（NMR）技術(shù)檢測(cè)與造血和免疫相關(guān)的體液和組織，如血清、胸腺、脾臟和骨髓的提取物，希望從生化代謝的分子層面找出與輻射所致血虛證及四物湯反證相關(guān)的代謝譜變化，從中發(fā)現(xiàn)相關(guān)生物標(biāo)記物，對(duì)血虛證的病理實(shí)質(zhì)及四物湯的藥理作用做進(jìn)一步探討。

1 材料與方法

1.1 藥物來源及制備 四物湯由熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎組成，按《太平惠民和劑局方》規(guī)定的劑量比例組成。藥物按本室以前報(bào)道方法制備[5]。

1.2 動(dòng)物分組與處理 實(shí)驗(yàn)用C57小鼠30只，體質(zhì)量（18±2）g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，合格證號(hào)為SCXK-（軍）-2002-001。將小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組和四物湯反證組，小鼠常規(guī)飼養(yǎng)數(shù)天適應(yīng)環(huán)境后，模型對(duì)照組和四物湯組采用60 Coγ射線全身1次照射，照射劑量3.5 Gy。照射后四物湯反證組立即灌以四物湯藥液[10 g/（kg·d）]，連續(xù)灌胃7 d[6]。

1.3 樣品制備及處理 于造模后第7天對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行股動(dòng)脈取血制備血清，處死動(dòng)物后取胸腺、脾臟以及股骨上段骨髓。按照參考文獻(xiàn)進(jìn)行1維氫譜（1H）NMR檢測(cè)樣品制備[7]。

1.41H NMR數(shù)據(jù)采集 血清：分別采用弛豫編輯脈沖序列（CPMG）、擴(kuò)散編輯脈沖序列（LED）進(jìn)行試驗(yàn)，采用預(yù)飽和方式抑制水峰，核磁共振自由感應(yīng)衰減（FID）信號(hào)經(jīng)過傅立葉變換轉(zhuǎn)為一維NMR譜圖。調(diào)用VNMR程序分別將CPMG譜的δ4.4～0.4以及LED譜的δ6.0～0范圍內(nèi)的譜峰進(jìn)行分段積分。將積分?jǐn)?shù)據(jù)歸一化之后輸出，用于模式識(shí)別分析[8]。

組織提取物：采用有預(yù)飽和的1D核歐豪斯效應(yīng)分光光度法（NOESY）脈沖序列，在弛豫延遲期間采用預(yù)飽和方式抑制水峰。FID信號(hào)經(jīng)過傅立葉變換轉(zhuǎn)換為一維NMR圖譜。以2，2，3，3－三甲基甲硅烷基丙酸（TSP）為化學(xué)位移參考峰的位置，將δ6.0～0.4（水溶性成分）以及 δ8～0（脂溶性成分）內(nèi)的譜圖進(jìn)行分段積分，將所產(chǎn)生的所有積分?jǐn)?shù)據(jù)歸一化，用于進(jìn)行模式識(shí)別分析[9]。

1.6 主成分分析 將所得到的數(shù)據(jù)文件輸入SIMCA-P10.0軟件包進(jìn)行PCA分析，必要時(shí)加上正交信號(hào)校正處理。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 輻射損傷所致血虛證小鼠血清代謝組學(xué)變化分別采用CPMG和LED序列檢測(cè)血清。結(jié)果顯示，正常組、輻射損傷所致血虛證模型組以及四物湯反證組血清代謝物的組成在第一主成分（PC1）上能夠明顯區(qū)分（圖1A、C）。從因子載荷圖中（圖1B、D）我們可以進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)對(duì)這種區(qū)分貢獻(xiàn)最大的代謝物分別為：葡萄糖、肌酐、磷酸化膽堿、膽堿、肌酸、乳酸、低密度脂蛋白。其中磷酸化膽堿、肌酸、低密度脂肪酸的含量上升，藥物處理后其含量下降；葡萄糖、膽堿、乳酸的含量下降，給予四物湯處理后其含量上升。

圖1 綜合放血法所致血虛證及四物湯反證小鼠血清代謝物變化的分析結(jié)果Fig.1 Analysison serum metabolic product inm icewith blood efficiency induced by synthetic blood-letting and with contrary syndromeof SIWu decoction

2.2 輻射損傷所致血虛證小鼠胸腺提取物的代謝組學(xué)變化 對(duì)胸腺水溶性和脂溶性提取物的主成分分析發(fā)現(xiàn)，正常組、輻射損傷所致血虛證模型組以及四物湯反證組之間能夠明顯的區(qū)分。其中，在水溶性提取物的主成分分析結(jié)果顯示，輻射損傷所致血虛證模型組與正常組和四物湯反證組兩組在第一主成分（PC1）與第二主成分（PC2）上均能有效的區(qū)分。

2.3 輻射損傷所致血虛證小鼠脾臟提取物的代謝組學(xué)變化 對(duì)脾臟水溶性提取物的主成分分析的結(jié)果顯示，輻射損傷所致血虛證模型組和四物湯反證組兩組與正常組之間有明顯不同，而模型組和四物湯反證組之間并不能有效的區(qū)分；對(duì)脂溶性提取物的主成分分析顯示，正常組與輻射損傷所致血虛證模型組以及四物湯反證組在第一主成分（PC1）上能夠明顯的區(qū)分。

2.4 輻射損傷所致血虛證小鼠骨髓提取物的代謝組學(xué)變化 對(duì)骨髓水溶性提取物的主成分分析發(fā)現(xiàn)，正常組與輻射損傷所致血虛證模型組以及四物湯反證組之間在第一主成分（PC1）上和在第二主成分（PC2）上均能夠明顯的區(qū)分；對(duì)骨髓脂溶性提取物的主成分分析發(fā)現(xiàn)，正常組和四物湯反證組兩組與輻射損傷所致血虛證之間有明顯的不同，四物湯反證組與正常組有重疊的趨勢(shì)。

4 討論

乳酸是糖酵解過程正常代謝產(chǎn)物，在缺氧的條件下在乳酸脫氫酶的催化下由丙酮酸生成，維持機(jī)體正常的能量代謝[10]。乳酸水平的異常提示機(jī)體能量代謝失調(diào)，機(jī)體無氧氧化功能受損；四物湯反證后，能夠明顯逆轉(zhuǎn)上述效應(yīng)，因此可以推測(cè)四物湯能夠改善機(jī)體的能量代謝。膽堿是乙酰膽堿的重要前體，是體內(nèi)的重要的甲基供體，是能量代謝和脂類代謝的重要參與者[11]。膽堿相對(duì)含量的改變就進(jìn)一步說明了血虛證模型中存在著能量代謝功能的損害，并提示機(jī)體可能有脂類代謝的失調(diào)，四物湯能夠明顯逆轉(zhuǎn)血虛證模型中膽堿含量的改變，可能與四物湯能夠改善機(jī)體的能量代謝和脂類代謝有關(guān)。?；撬崾求w內(nèi)一種重要的含硫氨基酸，具有穩(wěn)定細(xì)胞膜，協(xié)助鈣離子、鎂離子、鈉離子、鉀離子（Ca2+、Mg2+、Na+、K+）等離子的轉(zhuǎn)運(yùn)、維持細(xì)胞內(nèi)外正常的滲透壓的功能[12]。研究發(fā)現(xiàn)四物湯能夠改善造模后機(jī)體中牛磺酸的相對(duì)含量的改變，提示四物湯在維持細(xì)胞膜穩(wěn)定方面有一定的作用。丙氨酸是體內(nèi)重要的非必需氨基酸，有研究顯示丙氨酸是淋巴細(xì)胞再生及免疫過程中重要的參與者[13]；谷氨酰胺是體內(nèi)最豐富的游離氨基酸之一，具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用，是淋巴細(xì)胞分泌、增殖及其功能維持所必需的，研究發(fā)現(xiàn)在模型組中丙氨酸和谷氨酰胺的含量發(fā)生變化，由此推斷輻射造成機(jī)體的免疫功能受損，四物湯可以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能。

綜上所述，輻射損傷所致血虛證的機(jī)制可能與機(jī)體無氧氧化功能受損、能量代謝和脂類代謝失調(diào)、細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡破壞、機(jī)體免疫功能失調(diào)有關(guān)。經(jīng)典補(bǔ)血方劑四物湯治療血虛證的機(jī)制可能與穩(wěn)定細(xì)胞膜，維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡，調(diào)節(jié)糖酵解，促進(jìn)機(jī)體正常能量代謝以及增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力、免疫力有關(guān)，其深入的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。

[1]馬增春,高 月.血虛證的病理研究概況[J].新中醫(yī),2000,32(9):60-61.

[2]路曉欽，高 月，劉永學(xué)，等.四物湯對(duì)輻射小鼠造血功能影響的初步探討[J].中國中醫(yī)藥科技,2002,9(4):216-218.

[3]譚洪玲，馬增春，高 月，等.四物湯對(duì)血虛證小鼠骨髓細(xì)胞CD34抗原表達(dá)的影響[J].中藥新藥與臨床藥理,2002,13(1):11-13.

[4]郭 平，梁乾德，王升啟，等.四物湯對(duì)放射線致血虛證小鼠骨髓Epo和G-CSF基因表達(dá)的影響 [J].中國中藥雜志,2005,30(15):3-7.

[5]楊明會(huì)，馬增春，高 月，等.四物湯對(duì)血虛證患者血清蛋白質(zhì)的影響[J].中國中藥雜志,2008,33(4):420-423.

[6]陳 奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].第2版.北京：人民衛(wèi)生出版社,2006:28-29.

[7]雷榮輝,吳純啟,楊保華,等.納米銅經(jīng)口染毒大鼠血清的代謝組學(xué)研究[J].癌變畸變突變,2008,20(1):22-26.

[8]Lindon JC,Nicholson JK,Holmes E,etal.Metabonomics:Metabolic Processes Studied by NMR Spectroscopy ofBiofluids[J].Concepts in Magnetic Resonance,2000,12(5):289-320.

[9]Maria A.Constantinou,Stamatios E.Theocharis,EmmanuelMikros.Application ofmetabonomics on an experimentalmodel of fibrosis and cirrhosis induced by thioacetamide in rats[J].Toxicology and Applied Pharmacology,2007,218:11-19.

[10]Patel A B,Xia Y,Chowdhury GM,etal.Effectsof continoushypoxia on energy metabolism in cultured cerebro-corti-cal neurons[J].Brain Res,2008,1229:147-154.

[11]Pal K,Sharma U,Gupta DK,etal.Jagannathan NR:Metabolite profileof cerebrospinal fluid in patientswith spinabifida:aprotonmagnetic resonancespectroscopy study[J].Spine,2005,30(3):68-72.

[12]Nicholson JK,Wilson ID.Opinion:understanding'global'systems biology:metabonomics and the continuum ofmetabolism.Nat Rev DrugDiscov[J].2003,2(8):668-676.

[13]Norrelund H,Wiggers H,Halbirk M,et al.Abnormalities ofwhole body protein turnover,muscle metabolism and levels ofmetabolic hormones in patientswith chronic heart failure[J].J Intern Med,2006,260(1):11-21.

NMR-spectroscopy-basedmetabonom ic study on themousemodelof blood deficiency syndrome induced by radiation

HUOChao,WANGMu,MA Zeng-chun,etal
（Beijing Institute ofRadiation Medicine，Beijing 100850，China）

[Objection]To explore the essence ofblood deficiency syndrome and themechanism of the effectsof Siwutang based on the characteristic changes in metabolic profiles of C57 mice with blood deficiency induced by radiation before the treatment of Siwutang.[Methods]Thirty C57 mice were random ly divided into three groups of 10 animals:the control group and two blood deficiencymodel groupswithoutorwith Siwutang treatment.The animalswere sacrificed the 7th day after radiation and the blood,spleen,thymusand bone marrow were obtained.Themetabolic profilesofserum,aqueousand lipidic extractsof thymus,spleen and bonemarrow were investigated using 1H nuclearmagnetic resonance spectroscopy(NMR).The NMR spectrawere integrated in segments of 0.01 ppm,normalized and then analyzed using SIMCA-P software to visualize the similarities and differences inmetabolic profiles between these groups.[Results]Compared with the control group,themodelgroup contained different levels of lactate,choline,glucose,taurine,alanine,LDL,glycerin,UFA,creatinine,histidine,valine/leucine/isoleucine.In the Siwutang treated group,the above-mentioned changeswere reversed.[Conclusion]The injury established by radiation wasa kind ofpropermodel to develop furthermetabonomics researches.The disorderofenergymetabolism and osmoregulation，and the damage of immune function were observed by NMR-based-metabonomicsmethod.Siwutang,the classic complex for treating blood deficiency in clinic,could improve the immune function,accommodate energymetabolism and stabilize cellularmembrane.

radiation;Siwutang;blood deficiency;metabonomics;NMR

R285.5

A

1672-1519(2010)03-0233-03

國家自然基金資助項(xiàng)目（30672628，30730112）。

霍 超（1986-），女，碩士，主要從事中藥的代謝組學(xué)研究。

2010-01-30）