熒光定量PCR在高致病性豬藍耳病檢測上的應用

曹火仁，顧曉峰，朱 駿 ，沈林輝，孫文梅，曹向英

（1.上海市松江區動物疫病預防控制中心，上海 201611；2.上海交通大學農業與生物學院，上海 200240；3.上海市松江區食用農產品安全監督檢測中心，上海 201611）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）又稱豬藍耳病，是由PRRSV引起的一種嚴重危害養豬業的傳染病。近年來，我國南方大部分地區在高溫高濕季節發生的豬“無名高熱病”，經研究證實主要是由高致病性豬藍耳病病毒（豬繁殖與呼吸綜合征病毒）變異株引起的。由于當前的疫苗并不能提供完全有效的保護，因此，加強對高致病性豬藍耳病的監控對該病防制具有重要意義。為了了解松江地區高致病性豬藍耳病的隱性感染狀況，我們開展了高致病性豬藍耳病的實時熒光定量PCR檢測。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設備 ABI Prism 7500熒光PCR儀、SIGMA高速冷凍離心機、生物安全柜。

1.2 試劑 高致病性豬藍耳病實時熒光RT-PCR檢測試劑盒；病毒RNA提取試劑盒。

1.3 試驗材料 來源于松江區10個規模化豬場及8個生豬重點養殖地區的脾、淋巴結等組織病料以及血液樣品。

1.4 操作方法

1.4.1 樣本前處理 血液樣品經8000 r/min離心2min，取血清100μL加入300μL變性液混勻；組織樣品取0.5g加入1.5mL pH 7.2的PBS，研磨勻漿后，8000r/min離心2 min，取上清液100 μL加入300 μL變性液混勻。

1.4.2 模板制備 取若干個1.5 mL經DEPC水處理的滅菌離心管，加入已處理樣品 30μL，醋酸鈉溶液30μL，酚-氯仿-異戊醇液 300μL，顛倒 10次后，冰浴15min，4℃ 12000r/min 離心 15min，取 300μL上清液。再加入300μL異丙醇液混勻，置液氮中3min或-70℃冰箱中30min，取出，室溫溶化后，經4℃ 15000r/min離心20min后棄上清，緩緩滴入1mL 75%乙醇，旋轉一周后倒掉并倒扣于吸水紙上1 min，真空抽干15 min，加入10μL滅菌去離子水與RNA酶抑制劑混合液，-20℃儲存備用。

1.5 擴增試劑準備 根據所需反應管總數（包括樣本和陰陽性對照）計算出所需溶解的試劑球數（0.5×反應管數）；每個試劑球需要40μL試劑球溶液及0.5 μL Taq酶；在冰上溶解試劑，并輕輕扣擊使其充分混勻，含酶試劑不要旋渦振蕩；計算好各試劑的使用量，加入1.5mL到經DEPC水處理的滅菌離心管中，充分混勻，2000r/min離心10s，向設定的PCR反應管中分別加入20μL，再加入5μL到樣本模板及陰陽性對照管中，蓋上管蓋，置ABI 7500熒光PCR儀上。

1.6 熒光RT-PCR擴增與信號收集 熒光RT-PCR反應條件：42℃ 30 min，95℃ 10 min，1 個循環；95℃10min，45℃ 30s，72℃ 60s，5 個循環；95℃ 15s，58℃60s（收集熒光信號），40個循環。反應體系為25μL。

2 結果分析

2.1 結果判定標準 檢測樣本Ct值小于等于35，且擴增曲線有明顯的指數增長期，可判定為陽性。檢測樣本Ct值大于35且小于40時，重復1次，如果Ct值仍處于35～40，且擴增曲線有明顯的指數增長期，可判為陽性，否則判為陰性。檢測不到樣本Ct值或Ct值在40或以上，可判為陰性。

2.2 敏感性試驗 對已知高致病性豬藍耳病陽性核酸用紫外分光光度法測定其濃度，為4.98×109拷貝/μL，對其進行10倍梯度稀釋，仍能檢測到10-7（見圖1），表明熒光定量RT-PCR方法的靈敏度很高。

圖1 高致病性豬藍耳病熒光RT-PCR敏感性試驗

2.3 特異性試驗 設定非靶DNA（豬細小病毒、豬傳染性腦心肌炎病毒、豬偽狂犬病毒、豬流感病毒）及空白對照，驗證熒光定量RT-PCR檢測方法的特異性，結果全部為陰性反應（見圖2）。

圖2 高致病性豬藍耳病熒光RT-PCR特異性試驗

2.4 重復性與穩定性試驗 分別用熒光定量RT-PCR方法重復3次檢測病毒核酸含量為 1.0×109、1.0×108、1.0×107拷貝/μL的樣品，圖 3 中可以看出，R2=0.997124，說明Ct值在小于等于33時，具有很好的線性關系，表明該方法的穩定性好；圖4說明在3個濃度梯度稀釋下，其檢測結果一致。

圖3 高致病性豬藍耳病熒光RT-PCR敏感性試驗線性圖

圖4 高致病性豬藍耳病熒光RT-PCR重復性試驗

2.5 樣品檢測 運用實時熒光定量RT-PCR方法對所采集的8個生豬重點養殖地區的60份樣品（血液樣品50份、組織病料10份），以及10個規模化豬場的100份樣品（血液樣品81份、組織病料19份）進行高致病性豬藍耳病的檢測，結果均為陰性，表明松江區豬群中沒有高致病性豬藍耳病的隱性感染和健康帶毒。

3 討論

3.1 藍耳病的常用診斷方法有病毒中和試驗、酶聯免疫吸附試驗、間接免疫熒光試驗等，但存在操作復雜費時、靈敏度或特異性不強等缺點，而普通RT-PCR雖有很大提高，但易出現假陽性，且易造成EB等有害物質的污染，對人體健康有很大的危害。而TaqMan探針實時熒光RT-PCR技術以其敏感、特異、快速、準確的優點，在高致病性豬藍耳病的檢測上得到了廣泛應用。

3.2 鑒于近年來高致病性豬藍耳病的流行情況，我們仍然需要加大病原學監測力度，做好預測預警，防止疫情的發生。在做好高致病性豬藍耳病免疫工作的同時，應做好免疫抗體檢測工作，摸清其抗體消長規律，完善免疫程序，做到科學、有效的防控。

3.3 通過本次應用實踐，熟悉并完善了高致病性豬藍耳病實時熒光定量RT-PCR檢測方法。今后，可以在此基礎上摸索對禽流感、新城疫、豬瘟、豬偽狂犬、豬乙腦等重要疫病的監測，拓展實時熒光定量PCR檢測方法的應用范圍，為畜牧業健康發展構筑更高的技術平臺。

[1]Tian KG，Yu XL，Zhao TZ，et al.Emergence of fatal PRRSV variants：unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark[J].PLOS ONE，2007，2（6）：526.

[2]童光志，周 君，都 芳，等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及其分子流行病學分析[J].中國預防獸醫學報，2007，29（5）：323-327.

[3]范忠軍，柴 虹，王永明，等.豬繁殖與呼吸綜合征診斷技術研究[J].上海畜牧獸醫通訊，2007，（3）：62-63.

[4]蔡寶祥，姜 平.我國PRRS診斷技術與疫苗研究進展[J].畜牧與獸醫，2007，39（8）：1-4.