熒光定量PCR在高致病性豬藍耳病檢測上的應用

曹火仁，顧曉峰，朱 駿 ，沈林輝，孫文梅，曹向英

（1.上海市松江區(qū)動物疫病預防控制中心，上海 201611；2.上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院，上海 200240；3.上海市松江區(qū)食用農(nóng)產(chǎn)品安全監(jiān)督檢測中心，上海 201611）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）又稱豬藍耳病，是由PRRSV引起的一種嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病。近年來，我國南方大部分地區(qū)在高溫高濕季節(jié)發(fā)生的豬“無名高熱病”，經(jīng)研究證實主要是由高致病性豬藍耳病病毒（豬繁殖與呼吸綜合征病毒）變異株引起的。由于當前的疫苗并不能提供完全有效的保護，因此，加強對高致病性豬藍耳病的監(jiān)控對該病防制具有重要意義。為了了解松江地區(qū)高致病性豬藍耳病的隱性感染狀況，我們開展了高致病性豬藍耳病的實時熒光定量PCR檢測。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設備 ABI Prism 7500熒光PCR儀、SIGMA高速冷凍離心機、生物安全柜。

1.2 試劑 高致病性豬藍耳病實時熒光RT-PCR檢測試劑盒；病毒RNA提取試劑盒。

1.3 試驗材料 來源于松江區(qū)10個規(guī)模化豬場及8個生豬重點養(yǎng)殖地區(qū)的脾、淋巴結(jié)等組織病料以及血液樣品。

1.4 操作方法

1.4.1 樣本前處理 血液樣品經(jīng)8000 r/min離心2min，取血清100μL加入300μL變性液混勻；組織樣品取0.5g加入1.5mL pH 7.2的PBS，研磨勻漿后，8000r/min離心2 min，取上清液100 μL加入300 μL變性液混勻。

1.4.2 模板制備 取若干個1.5 mL經(jīng)DEPC水處理的滅菌離心管，加入已處理樣品 30μL，醋酸鈉溶液30μL，酚-氯仿-異戊醇液 300μL，顛倒 10次后，冰浴15min，4℃ 12000r/min 離心 15min，取 300μL上清液。再加入300μL異丙醇液混勻，置液氮中3min或-70℃冰箱中30min，取出，室溫溶化后，經(jīng)4℃ 15000r/min離心20min后棄上清，緩緩滴入1mL 75%乙醇，旋轉(zhuǎn)一周后倒掉并倒扣于吸水紙上1 min，真空抽干15 min，加入10μL滅菌去離子水與RNA酶抑制劑混合液，-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 擴增試劑準備 根據(jù)所需反應管總數(shù)（包括樣本和陰陽性對照）計算出所需溶解的試劑球數(shù)（0.5×反應管數(shù)）；每個試劑球需要40μL試劑球溶液及0.5 μL Taq酶；在冰上溶解試劑，并輕輕扣擊使其充分混勻，含酶試劑不要旋渦振蕩；計算好各試劑的使用量，加入1.5mL到經(jīng)DEPC水處理的滅菌離心管中，充分混勻，2000r/min離心10s，向設定的PCR反應管中分別加入20μL，再加入5μL到樣本模板及陰陽性對照管中，蓋上管蓋，置ABI 7500熒光PCR儀上。

1.6 熒光RT-PCR擴增與信號收集 熒光RT-PCR反應條件：42℃ 30 min，95℃ 10 min，1 個循環(huán)；95℃10min，45℃ 30s，72℃ 60s，5 個循環(huán)；95℃ 15s，58℃60s（收集熒光信號），40個循環(huán)。反應體系為25μL。

2 結(jié)果分析

2.1 結(jié)果判定標準 檢測樣本Ct值小于等于35，且擴增曲線有明顯的指數(shù)增長期，可判定為陽性。檢測樣本Ct值大于35且小于40時，重復1次，如果Ct值仍處于35～40，且擴增曲線有明顯的指數(shù)增長期，可判為陽性，否則判為陰性。檢測不到樣本Ct值或Ct值在40或以上，可判為陰性。

2.2 敏感性試驗 對已知高致病性豬藍耳病陽性核酸用紫外分光光度法測定其濃度，為4.98×109拷貝/μL，對其進行10倍梯度稀釋，仍能檢測到10-7（見圖1），表明熒光定量RT-PCR方法的靈敏度很高。

圖1 高致病性豬藍耳病熒光RT-PCR敏感性試驗

2.3 特異性試驗 設定非靶DNA（豬細小病毒、豬傳染性腦心肌炎病毒、豬偽狂犬病毒、豬流感病毒）及空白對照，驗證熒光定量RT-PCR檢測方法的特異性，結(jié)果全部為陰性反應（見圖2）。

圖2 高致病性豬藍耳病熒光RT-PCR特異性試驗

2.4 重復性與穩(wěn)定性試驗 分別用熒光定量RT-PCR方法重復3次檢測病毒核酸含量為 1.0×109、1.0×108、1.0×107拷貝/μL的樣品，圖 3 中可以看出，R2=0.997124，說明Ct值在小于等于33時，具有很好的線性關(guān)系，表明該方法的穩(wěn)定性好；圖4說明在3個濃度梯度稀釋下，其檢測結(jié)果一致。

圖3 高致病性豬藍耳病熒光RT-PCR敏感性試驗線性圖

圖4 高致病性豬藍耳病熒光RT-PCR重復性試驗

2.5 樣品檢測 運用實時熒光定量RT-PCR方法對所采集的8個生豬重點養(yǎng)殖地區(qū)的60份樣品（血液樣品50份、組織病料10份），以及10個規(guī)模化豬場的100份樣品（血液樣品81份、組織病料19份）進行高致病性豬藍耳病的檢測，結(jié)果均為陰性，表明松江區(qū)豬群中沒有高致病性豬藍耳病的隱性感染和健康帶毒。

3 討論

3.1 藍耳病的常用診斷方法有病毒中和試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗、間接免疫熒光試驗等，但存在操作復雜費時、靈敏度或特異性不強等缺點，而普通RT-PCR雖有很大提高，但易出現(xiàn)假陽性，且易造成EB等有害物質(zhì)的污染，對人體健康有很大的危害。而TaqMan探針實時熒光RT-PCR技術(shù)以其敏感、特異、快速、準確的優(yōu)點，在高致病性豬藍耳病的檢測上得到了廣泛應用。

3.2 鑒于近年來高致病性豬藍耳病的流行情況，我們?nèi)匀恍枰哟蟛≡瓕W監(jiān)測力度，做好預測預警，防止疫情的發(fā)生。在做好高致病性豬藍耳病免疫工作的同時，應做好免疫抗體檢測工作，摸清其抗體消長規(guī)律，完善免疫程序，做到科學、有效的防控。

3.3 通過本次應用實踐，熟悉并完善了高致病性豬藍耳病實時熒光定量RT-PCR檢測方法。今后，可以在此基礎(chǔ)上摸索對禽流感、新城疫、豬瘟、豬偽狂犬、豬乙腦等重要疫病的監(jiān)測，拓展實時熒光定量PCR檢測方法的應用范圍，為畜牧業(yè)健康發(fā)展構(gòu)筑更高的技術(shù)平臺。

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