人腦膠質瘤細胞兩種分離方法的對比研究

劉建熙 張鵬遠 張玉杰 鄧 巍

鄭州大學第二附屬醫院 鄭州 450014

膠質細胞瘤發生率較高，據文獻統計，占顱內腫瘤的35.26％～60.96％，居第一位［1］。膠質瘤細胞的純化分離培養對于離體條件下進行膠質瘤細胞的預測化學及放射敏感性實驗研究具有廣泛的實用價值［2］。近來也用于逆病毒介導療法［3］和用腦腫瘤選擇性肽配體靶向融合［4］的研究。實驗所采集腫瘤組織來自鄭州大學二附院神經外科，術后均經病理證實為膠質細胞瘤，組織學分級1級3例，4級1例。本實驗對膠質瘤細胞的兩種分離純化方法進行了對比研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料D－PBSA緩沖液自行配置后高溫高壓滅菌；DMEM/F12（1∶1）培養基（美國HyClone公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；0.25％胰蛋白酶（美國Sigma公司）；標準篩：直徑分別為1 mm和74μm（浙江省上虞市道墟張興紗篩廠）

1.2 方法機械分離法［5］：將術中無菌狀態收集的膠質瘤組織于無菌狀態取一部分以D－PBSA沖洗3遍，而后用手術刀將組織切碎為3～5mm3大小，每次取幾塊組織放在標準篩上，篩置于9cm皮氏皿上（皮氏皿中加有培養基）。用注射器芯輕輕加壓使組織通過篩孔進入培養基，吸取培養基吹過篩網將細胞沖下。吸取分離的組織加入74μm孔徑的標準篩，再次過濾。用血球計數板進行細胞計數。冷胰酶消化法［5］：將剩下的腫瘤組織如前所敘，清洗、切碎后將其移入一個預先稱重的15mL無菌離心管中。用D－PBSA離心清洗組織塊3次（離心速度為800r/min），去除上清液，稱重。每克組織加入10mL溶于DMEM/F12的0.25％胰蛋白酶，4℃放置6～18h。吸去胰蛋白酶，37℃孵育20min，加入溫培養基，約以100mg的初始組織加1mL。用吹打管吹打混合物至組織完全分散開。用血球計數板進行細胞計數。

1.3 純化計數后按約2×105/cm2接種于50 m L無菌培養瓶中，采用速差貼壁法［6］處理。

1.4 分離細胞的免疫熒光及Giemsa染色鑒定膠質瘤組織用兩種方法分離后在免疫熒光顯微鏡下所見細胞密度差異。Giemsa染色后觀察所見：圖片中細胞核為紫羅蘭色，核仁藍黑色，細胞質透光發亮。可見細胞及細胞核形狀、大小不一，并出現雙核及多核現象。見圖1、圖2、圖3。

圖1 冷胰酶消化法所分離細胞圖片200倍

圖2 機械分離法所分離細胞圖片200倍

圖3 培養后Giemsa染色圖片400倍

1.5 統計學方法采用SAS 9.1統計軟件進行分析，所有計量資料用均數±標準差（±s）表示，應用配對樣本t檢驗比較兩組細胞計數的差異。檢驗水準取α＝0.05。

2 結果

見表1。

表1 膠質細胞瘤分離后細胞計數

3 討論

機械分離法這種操作比冷胰酶消化法速度較快，但隨著篩網孔徑的變小而產生的剪切力對細胞的機械損傷也隨之增加，對于較軟的組織這是一種成功的方法。而冷胰酶消化法可獲得較高的細胞存活數量，這是因為在4℃時胰蛋白酶活性較小，長時間的浸泡不僅胰蛋白酶可以充分滲入到組織中，而且對組織的損傷也很小，所以培養36h后生存率也較高，同時可保留較多的細胞種類。不足之處是該方法所需時間稍長，并且胰蛋白酶消化的濃度不好掌握，可能會破壞有助于細胞存活的細胞表面黏附分子、細胞基質等細胞成分［7］。機械分離法適用于較軟的組織，但是懸液中存活的細胞數較少。若組織取材不受限，細胞數量無關緊要，在短時間內可產生與冷胰酶消化同樣多的活細胞。然而兩種方法相結合有可能會有較好的效果

目前，細胞培養已成為生命科學領域中的一項關鍵按技術。在體外培養條件下借助細胞超微結構的研究手段［8］，將為我們深入研究膠質細胞瘤增殖、凋亡相關的分子機制提供了新的線索和手段。在醫藥學領域，進行細胞治療的關鍵程序即是細胞的增殖細胞的基因修飾和細胞的誘導分化等，這也需要借助細胞培養這一關鍵技術。可以預期，在今后的生命科學與醫藥學的研究中，細胞培養還將會有更廣泛的應用。而細胞的分離則是細胞培養的第一步，故此選擇一個合適的細胞分離方法顯得尤為重要。

［1］王忠誠.神經外科學［M］.武漢：湖北科學技術出版社，2005：512－513.

［2］Thomas DGT，Darling JL，Paul EA，et al.Assay of anti－cancer drugs in tissure culture：Relationship of relapse free interval（FRI）and in vitro chemosensitivity in patients with malignant cerebral glioma［J］.Br J Cancer，1985，51：525－532.

［3］Rainov NG，Ren H.Clinical trals with retrovirus mediated gene therapy－what have we learned？［J］.J Neurooncol，2003，65：227－236.

［4］Liu TF，Cohen KA，Willingham MC，et al.Combination fusion protein therapy of refractory brain tumors：demonstration of efficacy in cell culture［J］.J Neurooncol，2003，65：77－85.

［5］Ian Frshney著.章靜波，徐存栓等，譯.動物細胞培養［M］.北京：科學出版社，2008：247－250；258.

［6］蔣偉，法憲恩，李曉召.乳鼠竇房結細胞的分離純化與形態學研究［J］.醫學信息內·外科版，2009，22（12）：1 075.

［7］劉永海，趙蓮花，趙輝，等.大鼠胎腦皮質神經干細胞體外培養及誘導分化的實驗研究［J］.中國實用神經疾病雜志，2006，9（6）：3－4.

［8］陳剛，秦尚振，馬廉亭，等.人胚神經干細胞的體外培養和超微結構觀察［J］.中國臨床神經外科雜志，2006，11（2）：92－97.